多菌靈降解菌的分離、鑒定及其降解特性研究.pdf

1、從長期受多菌靈污染的土壤和處理多菌靈廢水的污泥中分離到3株高效多菌靈降解菌株，分別命名為djl-6、djl-6-2和CBDM-12。根據(jù)它們的培養(yǎng)特征、生理生化特征以及16S rDNA序列的同源性分析等，鑒定為紅球菌屬。
　　 研究表明，這3株多菌靈降解菌都是革蘭氏陽性菌，有球桿狀變化，都能在添加多菌靈的無機鹽平板上產(chǎn)生清晰可見的透明圈；其中djl-6在LB上培養(yǎng)時，菌落呈橙色；djl-6-2和CBDM-12菌落呈乳黃色；3株菌

2、的最適生長溫度為30℃、pH值為7.0；都能耐受一定濃度的NaCl和抗生素；對葡萄糖和果糖等單糖的利用要好于麥芽糖和淀粉等多糖，對蛋白胨、牛肉膏和酵母等有機氮源的利用明顯的優(yōu)于以硫酸銨等無機氮源。
　　 降解菌株均能以多菌靈為唯一碳、唯一氮和唯一碳氮源進行生長。3株菌以多菌靈為唯一氮源時的生長和降解速度均好于以多菌靈為唯一碳和唯一碳氮源時的生長和降解速度。它們均能在2～3天時間內(nèi)幾乎完全降解100mg.L-1的多菌靈，降解效果明

3、顯優(yōu)于國內(nèi)外已經(jīng)報道的多菌靈降解菌株；降解菌株在中性稍微偏堿的環(huán)境中更有利于其對多菌靈的降解，它們降解多菌靈的最適溫度都為30℃，其中菌株djl-6和djl-6-2降解多菌靈有比較寬的溫度耐受范圍；它們降解多菌靈的最適的Na+濃度范圍為20～30 g.L-1，通氣量對3株菌降解多菌靈的影響不大；添加酵母粉和葡萄糖對多菌靈的降解有一定的促進作用，添加土壤浸液對多菌靈的降解沒有影響；Cu2+對3株菌降解多菌靈有一定的抑制作用，其他的金屬離子

4、對多菌靈的降解沒有太大影響；3株菌都能有效的降解苯菌靈和苯酚，對速滅威和甲霜靈也有一定的降解效果；所有這些特性表明3株菌可作為多菌靈污染生物修復(fù)的理想材料。
　　 系統(tǒng)發(fā)育分析和生理生化特征比較分析結(jié)果表明，djl-6和Rhodococcusbaikonurensis、Rhodococcus erythropolsis親緣關(guān)系較近，和Rhodococcusgloberulus較遠；多相分類結(jié)果表明，djl-6細胞中主要的脂肪酸組

5、成為：C14:08.12％、C15:0 ISO2OH8.49％、C16:025.97％、C18:07.01％、C18:1 w9c7.32％、C18:0 TBSA10Me19.81％、C19:04.31％、C20:03.36％；氨基酸為：meso-DAP、Ala、Glu、Gly和Asp；糖為半乳糖，阿拉伯糖和葡萄糖；醌為MK-8(H2)；G+C mol％為59.1；djl-6和R.baikonurensis DSM44587、R.erth

6、ropolis DSM43066，R.globerulus DSM43954的DNA-DNA雜交同源性分別為23.8518％、31.8361％和-17.7155％(為0％)。所有這些特性表明djl-6是紅球菌屬中的一個新種，初步命名為慶笙紅球菌Rhodococcus qingshengensis sp.nov.。
　　 多菌靈降解酶是一種胞內(nèi)非諺導(dǎo)組成型的酶。在提取該酶時，可把djl-6在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到72～84h為宜，然后

7、可采用添加溶菌酶、超聲波破碎或French壓榨等方法來提取。采用添加溶菌酶方法提取的降解酶酶活較高，而采用超聲波和French壓榨破碎雖然提取的酶量較大，所得總蛋白濃度也較高，但是酶活損失較大；多菌靈降解酶的最佳反應(yīng)體系為在pH7.0的緩沖系統(tǒng)中，控制溫度為30℃，在5mL反應(yīng)體系中添加30μL的粗酶液，反應(yīng)時間控制在1小時之內(nèi)，通常為30分鐘；多菌靈降解酶在pH7.0～8.0，溫度4～45℃的范圍內(nèi)較穩(wěn)定；金屬離子Zn2+和K+對酶活

8、有抑制作用。添加Tween20對酶活測定沒有影響，而添加Triton X-100和SDS，當(dāng)濃度超過100mg.L-1時就能對降解酶的活性產(chǎn)生一定地抑制作用；粗酶液的硫酸銨分級沉淀效果表明，當(dāng)在上清液中添加硫酸銨濃度達到50％后，上清液中的酶活驟然降低。沉淀蛋白在硫酸銨的添加濃度達到40％以后，酶活就驟然上升，在50％以后達到最大。所以在用硫酸銨沉淀粗酶時可選擇50％的硫酸銨沉淀濃度對降解酶進行粗分；同時降解酶能夠在添加多菌靈的非變性膠

9、上產(chǎn)生清楚可見的透明帶。與此透明帶對應(yīng)的條帶酯酶染色表明，該酶同時也是一種酯酶。把分離膠中的透明帶切膠回收，可回收到一條分子量大小在97.4～66.2Kda之間的目的蛋白。
　　 對多菌靈代謝過程進行跟蹤研究，發(fā)現(xiàn)在djl-6接種24小時后有三種中間代謝物存在，分別是2-氨基苯并咪唑(m/z=134.3)、苯并咪唑(m/z=119.3)和一種分子離子峰為104.8和118.5的未知物質(zhì)。而經(jīng)過2～3天的培養(yǎng)后，HPLC分析表明1

10、00mg.L-1的多菌靈幾乎被完全降解。推測多菌靈可能首先被轉(zhuǎn)化為2-氨基苯并咪唑，然后再進一步被轉(zhuǎn)化，最后被完全降解。本研究也是首次發(fā)現(xiàn)2-氨基苯并咪唑和苯并咪唑在純菌多菌靈代謝物中同時存在。
　　 djl-6在紅壤、潮土和高沙土中的降解實驗表明，其在土壤中降解多菌靈需要一定的水分含量，稍高的水分含量有利于其對多菌靈的降解，但完全淹水的條件又會影響到其降解功能的發(fā)揮；與最適生長特點相符，在土壤中djl-6適宜的降解pH和溫度分

11、別為7.0和30℃；三種土壤中多菌靈的降解主要是由降解菌完成的，且接種量越大降解效果越好；添加葡萄糖對djl-6降解土壤中多菌靈有一定地促進作用。
　　 投加多菌靈和djl-6對紅壤、潮土和高沙土三種土壤酶活性的影響表明，對過氧化氫酶活性的影響都是加降解菌的酶活要高于未加菌的酶活。未加菌處理初期都表現(xiàn)出抑制現(xiàn)象，而后又緩慢得到恢復(fù)；對土壤脫氫酶活性的影響，高沙土和紅壤、潮土的實驗結(jié)果相反，在加菌處理和未加菌處理中脫氫酶活性一開始