咔唑降解菌株的篩選及其鄰裂雙加氧酶的克隆與鑒定.pdf

1、本研究從吉林化工廠污水排污口於泥、四平金士百啤酒廠污水排污口於泥、四平聯(lián)合化工有限公司污水排污口於泥和江蘇常州咔唑生產(chǎn)廠地表污染土四個(gè)樣品中分離到12株可以在咔唑?yàn)槲ㄒ惶荚春偷吹腃NFMM選擇固體平板上良好生長(zhǎng)的革蘭氏陰性細(xì)菌株。通過16S rDNA基因序列比對(duì)分析，12個(gè)菌株分別屬于6個(gè)菌屬。JH061、PJ062、JS061和JS062四個(gè)菌株屬于鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.)；JH051、PJ051、PJ05

2、2和LH051屬于芽孢桿菌(Bacillusr sp.)；JH052屬于金黃桿菌屬(Chryseobacteriumsp.)、JH062屬于黃色氫噬胞菌(Hydrogenophaga intermedia)、PJ053屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp.)和PJ061屬于Pandoraea sp.。 研究了節(jié)桿菌PJ053菌株的最適生長(zhǎng)條件以及進(jìn)化關(guān)系。與大腸桿菌JM109相比生長(zhǎng)速度稍慢，30℃和pH 7為PJ053

3、菌株的最適培養(yǎng)條件。菌落較光滑，邊緣整齊，呈明亮的黃色，菌落形狀比較有規(guī)則，呈圓形，菌株呈短桿狀。進(jìn)化樹表明節(jié)桿菌PJ053與四個(gè)未培養(yǎng)的細(xì)菌形成一簇，而與已知的節(jié)桿菌如Arthrobacter sp 14等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。 構(gòu)建了PJ053菌株基因組文庫(kù)并獲得兩株陽(yáng)性克隆JM109(pUCW402)和JM109(pUCW331)。通過GenSCAN軟件和BLAST分析發(fā)現(xiàn)，在插入pUCW402的外源片段(3359bp)中存在一

4、個(gè)由933bp編碼的2，3-二羥基聯(lián)苯雙加氧酶(23DHBD)基因，一個(gè)錨蛋白基因而且在DHBD基因的上游區(qū)域可能存在一個(gè)羥化酶。pUCW331質(zhì)粒中插入片段的長(zhǎng)度為3967bp，GenSCAN軟件和BLAST分析表明有3，4-二羥苯乙酸-2，3-雙加氧酶(HPCD)基因和5-羧甲基2-羥基粘康酸半醛脫氫酶基因存在于這一序列中，而且也有可能存在一個(gè)金屬依賴的磷酸水解酶基因。 進(jìn)化分析表明，來源于PJ053菌株的23DHBD沒有與

5、已知的23DHBD形成一簇而是形成一個(gè)獨(dú)立的分支。Southern雜交進(jìn)一步證實(shí)編碼該酶的基因定位于節(jié)桿菌PJ053的基因組DNA上。本文首次報(bào)道在節(jié)桿菌PJ053中發(fā)現(xiàn)了2，3-二羥基聯(lián)苯雙加氧酶(23DHBD)基因。為了證實(shí)933bp(包括終止密碼子TAG)編碼的23DHBD基因和1098bp編碼HPCD基因具備生物學(xué)功能，利用構(gòu)建過表達(dá)載體pETW402和pETW331，研究了在重組菌株BL21(pETW402)和BL21(pET

6、W331)23DHBD和HPCD的表達(dá)情況及酶活分析。鄰苯二酚噴霧表明，兩個(gè)菌株表達(dá)的酶都具備將鄰苯二酚轉(zhuǎn)化為黃色產(chǎn)物2-羥基粘康酸半醛的活性。與菌株JM109(pUCW402)、JM109(pUCW331)和PJ053相比，23DHBD和HPCD的表達(dá)水平分別在BL21(pETW402)和BL21(pETW331)中最高。酶活分析表明，23DHBD不具有絕對(duì)專一性，對(duì)2，3-二羥基聯(lián)苯的催化能力高于鄰苯二酚。因此推測(cè)PJ053菌株對(duì)芳

7、香族化合物降解過程中，23DHBD主要負(fù)責(zé)催化雙環(huán)化合物的降解。 利用Ni-NTA agarose介質(zhì)對(duì)BL21(pETW402)和BL21(pETW331)兩菌株表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，制備了多克隆抗體。Western-blot分析了基因工程菌株和野生菌PJ053菌體內(nèi)表達(dá)23DHBD蛋白和HPCD蛋白的水平。結(jié)果表明，基因工程菌JM109(pUCW402)和BL21(pETW402)菌體內(nèi)表達(dá)的23DHBD蛋白要遠(yuǎn)高于PJ053

8、野生型菌株；HPCD蛋白在不同菌株中的表達(dá)情況也表現(xiàn)出相同的結(jié)果。本研究還利用鞘氨醇單胞菌KA1的CarB基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，從鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.)JS061,11黃色氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga intermedia)JH062克隆到carB(2’-氨基聯(lián)苯-2，3-二醇-1，2-雙加氧酶)基因。底物顯色法證實(shí)該基因編碼的酶具備將2，3-二羥基聯(lián)苯轉(zhuǎn)化為2-羥基-6-氧-6-苯基已二烯酸的活性