高效棉酚降解菌株的篩選鑒定及其差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、棉籽餅粕是一種重要的植物蛋白飼料資源，但是其中含有一種對(duì)動(dòng)物有害的抗?fàn)I養(yǎng)因子—棉酚，從而限制了其在飼料中的應(yīng)用。目前，現(xiàn)有的一些脫毒方法，如有機(jī)溶劑萃取、硫酸亞鐵處理、微生物發(fā)酵等，對(duì)棉籽餅粕的解毒起到了一定的作用。尤其是微生物發(fā)酵降解棉酚，不僅可使棉籽餅粕脫毒，同時(shí)還可提高棉籽蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。雖然棉籽餅粕發(fā)酵脫毒優(yōu)點(diǎn)已被公認(rèn)，但是迄今為止，人們對(duì)微生物發(fā)酵脫毒的分子機(jī)理尚不清楚。本研究以純棉酚為碳源，從土壤中篩選了2株棉酚降解菌，采用

2、形態(tài)學(xué)觀(guān)察及分子生物學(xué)方法進(jìn)行菌種鑒定，通過(guò)分析棉酚降解菌的培養(yǎng)條件對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行初步探討，并利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析棉酚降解菌在不同碳源中的蛋白質(zhì)表達(dá)差異。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.以醋酸棉酚為唯一碳源，從土壤中篩選棉酚降解菌。從平板上得到2株高效降解棉酚的菌體，分別命名為AN-1、MM-2。從形態(tài)上觀(guān)察及電鏡結(jié)果顯示：AN-1和MM-2均為絲狀真菌。通過(guò)分子生物學(xué)方法對(duì)棉酚降解菌進(jìn)一步鑒定表明：AN-1的18S rDNA

3、序列與黑曲霉(Aspergillus niger)的同源性高達(dá)99％以上，據(jù)此推測(cè)AN-1可能屬于A. niger；MM-2的18S rDNA序列與鐮刀霉屬(Fusarium)的同源性達(dá)98％以上，據(jù)此推測(cè)MM-2可能屬于Fusarium sp.。
　　 2.對(duì)分離到的棉酚降解菌進(jìn)行培養(yǎng)特性研究，以獲得其最佳生長(zhǎng)條件，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。生長(zhǎng)曲線(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果顯示：棉酚降解菌AN-1和MM-2表現(xiàn)出相似生長(zhǎng)趨勢(shì)，即在葡萄糖中生長(zhǎng)優(yōu)于

4、在棉酚中生長(zhǎng)，培養(yǎng)60～84 h取種用于研究最好。溫度試驗(yàn)結(jié)果顯示：棉酚降解菌AN-1和MM-2在棉酚及葡萄糖中的生長(zhǎng)情況類(lèi)似，即30℃時(shí)菌體生物量達(dá)最大值，且在葡萄糖中的生長(zhǎng)略好于棉酚。pH試驗(yàn)結(jié)果顯示：棉酚降解菌AN-1和MM-2在葡萄糖和棉酚中培養(yǎng)時(shí)pH值均呈下降趨勢(shì)，但在葡萄糖中較之棉酚中下降明顯。氮源試驗(yàn)結(jié)果顯示：不同氮源對(duì)棉酚降解菌AN-1和MM-2的影響均有相似趨勢(shì)，即在銨鹽及硝酸鹽中生長(zhǎng)比在酵母膏和尿素中好，且最佳氮源為

5、NaNO3。棉酚耐受性試驗(yàn)結(jié)果表明：棉酚降解菌AN-1在5種不同濃度(0.05％,0.1％,0.2％,0.4％,0.8％)的棉酚中生長(zhǎng)時(shí)具有明顯差異，且AN-1對(duì)棉酚具有極強(qiáng)的耐受性，確定棉酚最適添加量為0.2％。
　　 3.采用TCA/丙酮沉淀法提取棉酚降解菌AN-1在葡萄糖和棉酚中生長(zhǎng)72h后的菌體蛋白，得到了分辨率較好的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，蛋白質(zhì)分子量主要集中在25.0～66.2kDa之間，各pI段均有分布。通過(guò)PDQue

6、st軟件分析，葡萄糖凝膠圖譜中平均檢測(cè)到478個(gè)蛋白點(diǎn)，棉酚凝膠圖譜中平均檢測(cè)到592個(gè)蛋白點(diǎn)；以葡萄糖為參考膠，棉酚為碳源的2-DE圖譜中平均匹配的蛋白點(diǎn)為293個(gè)，未匹配的蛋白點(diǎn)有299個(gè)，其中有51個(gè)為差異蛋白點(diǎn)。采用MALDI-TOF MS方法對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，獲得了47張PMF圖譜，鑒定出其中20個(gè)蛋白點(diǎn)，包括1個(gè)kinesin,2個(gè)glycerol-3-phosphate dehydrogenase,1個(gè)citrat