珙桐FCA與FT基因的克隆及表達.pdf

1、珙桐（Davidia involucrata Baill.）又名鴿子樹，是第三紀古熱帶植物孑遺種，具有很高的觀賞價值、藥用價值和科研價值。珙桐對生長環(huán)境要求苛刻，成熟幼苗的繁殖率低，珙桐屬多年生喬木，有性生殖世代周期長，開花研究十分重要。FCA(Floweringcontrol locus a)基因和FT(Flowering Locus T)基因分別是開花植物自主途徑和光周期途徑中的重要的調控基因。本實驗利用得到的珙桐種子轉錄組基因庫片

2、段基因，進行同源比對克隆、RACE等方法獲得珙桐的FCA基因全長序列以及FT部分序列，并通過qRT-PCR分析珙桐FCA和FT的表達模式，為后續(xù)的開花基因功能和轉基因開花機理研究提供了一定幫助，由于珙桐材料難以獲得，本實驗在前期對珙桐材料的獲取中，做了一定量的組培實驗，以保證后期能夠做更多的實驗拓展。本研究獲得了如下結果:
　　1、珙桐組織培養(yǎng)快速繁殖技術的建立
　　取飽滿、剛結出的果實，采取100％酒精灼燒滅菌，取帶胚乳的

3、種胚，接種于不加激素的WPM基本培養(yǎng)基中，生長一定時間后去掉外胚乳，能夠完整、快速的生長。珙桐在組培培養(yǎng)基上褐化程度較高，導致珙桐組培成活率低，用根、莖、葉等培養(yǎng)愈傷組織較難。本研究打破珙桐種子的自然休眠期，避免了組織培養(yǎng)中根、莖、葉等再生困難、生根率低成本高等一系列問題，為后續(xù)實驗材料的獲取以及轉基因組培苗建立了簡單快速繁殖的方法。
　　2、珙桐FCA及FT基因的克隆
　　利用RACE及普通PCR技術克隆獲得了珙桐DiFC

4、A（Davidia involucrata FCA）完整ORF序列1596bp，并能編碼的保守功能結構域（RRM2、WW-蛋白互作），編碼531個氨基酸。生物信息學分析DiFCA基因為珙桐FCA家族中轉錄前調控的一種，且該蛋白為親水蛋白，并預測該蛋白主要位于細胞核和微體中。并克隆出了珙桐DiFT（Davidia involucrata FT）部分ORF序列321bp，分析其具有PEBP家族保守結構D-P-D-A-P，第86位H-(組氨酸

5、殘基)，以及底物結合位點86位的H-和FT亞家族保守位點84位的Y-（絡氨酸殘基），推測其屬于珙桐FT基因。
　　3、DiFCA和DiFT基因的表達分析
　　熒光定量PCR分析DiFT與DiFCA基因表明:
　　1)開花起始時期的珙桐樹中，DiFCA在花芽組織（花器官）中表達最多，在大、小苞片中表達較多，老葉中次之，嫩葉中表達最少;DiFT在老葉中遠高于其他組織，嫩葉中最少。
　　2)在同一棵樹開花周期內，DiF

6、CA與DiFT隨著開花過程的進行具有相同的趨勢，隨著開花的周期的變化，先上升后下降，但DiFT的表達峰值較早于DiFCA。DiFCA基因在花序的表達量略高于在葉片中的表達量;而DiFT基因在老葉中的表達量遠高于花序中的表達量;在同一葉片組織中，隨開花周期的進行，自主途徑DiFCA表達量的峰值與珙桐開花盛開程度基本成符合，DiFT的表達量峰值略早于開花茂盛程度的高峰期，反應了光周期途徑的敏感性。
　　3)開花周期起始日，在不同的海拔

7、高度的珙桐樹:珙桐樹在900-1300米內，隨著海拔的升高，DiFCA的表達量逐漸下降，DiFT的表達量則先上升后下降，開花起始日(4月27)在900米為最適開花環(huán)境，越往上走則開花狀態(tài)延遲。在低海拔地區(qū)（不開花珙桐）DiFCA的表達量較低，但未檢測出DiFT的表達。
　　4)在一年生的珙桐組培苗定量中:在下胚軸和頂芽中存在較微量的DiFCA基因的表達，而DiFT則未檢測出表達;在假子葉、真葉中均未檢測出DiFCA和DiFT的表達