蘋(píng)果Flowering locus T(FT)基因及其啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、開(kāi)花是植物生命周期的一個(gè)重要組成部分，也是果樹(shù)發(fā)育的重要過(guò)程。蘋(píng)果作為多年生木本植物，童期較長(zhǎng)，育成一個(gè)品種要耗費(fèi)10～20年，因此研究蘋(píng)果開(kāi)花的分子機(jī)理，對(duì)果樹(shù)育種及其遺傳研究都具有重要的意義。一方面，縮短童期可以加速果樹(shù)的遺傳改良和試驗(yàn)研究進(jìn)程。另一方面，可以實(shí)現(xiàn)果樹(shù)的早實(shí)豐產(chǎn)。Following locus T（FT）基因在擬南芥和瓜類(lèi)等植物中被證明為“成花素”類(lèi)物質(zhì)，決定著開(kāi)花時(shí)間，可激活花分生組織特征基因，誘導(dǎo)植物開(kāi)花。對(duì)果樹(shù)

2、FT同源基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律及其功能的研究，有利于了解果樹(shù)成花和階段轉(zhuǎn)變的分子機(jī)理，為進(jìn)一步利用基因工程改良品種提供依據(jù)。
　　 1，蘋(píng)果FT基因的克隆與表達(dá)分析
　　 為探明蘋(píng)果FT同源基因的功能和表達(dá)規(guī)律，本研究以‘富士’蘋(píng)果為材料，獲得了長(zhǎng)為598 bp的FT基因的cDNA序列，命名為MdFT3（GenBank登錄號(hào)：GQ465756）。經(jīng)PCR克隆和序列分析驗(yàn)證，結(jié)果表明，該cDNA序列具有完整的開(kāi)放閱讀框（ORF）

3、，推測(cè)編碼174個(gè)氨基酸。其氨基酸序列與蘋(píng)果MdFT2（FJ555224）、蘋(píng)果MdFTL（AB161112）、桃PpFT（EU939302）、楊樹(shù)PdFTL1（AY515152）和葡萄VvFT（EF157728）的FT/FTL同源性分別為99.4％、93.7％、96.6％、87.4％和89.1％。進(jìn)化分析表明，MdFT3屬于PEBP家族中的FT亞家族，與桃PpFT和果梅PmFT親緣關(guān)系最近，與黑楊PnFT、柑橘CiFT和枳CTRSFT

4、L1等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　 采用半定量RT-PCR分析MdFT3基因在蘋(píng)果種子、幼果、不同時(shí)期的葉片、以及花的不同時(shí)期、不同器官和組織中的表達(dá)水平，結(jié)果表明：MdFT3基因在種子、幼果、葉以及花中均有表達(dá)。在葉片中，MdFT3基因的表達(dá)隨葉片發(fā)育呈下降趨勢(shì)，葉芽中的表達(dá)量較高。在種子中MdFT3基因表達(dá)量較低。在花器官中，隨著花器官的發(fā)育，MdFT3基因的表達(dá)整體呈下降趨勢(shì)，以小蕾期的表達(dá)量最高?；ㄆ鞴僦校ㄋ幒妥臃康谋磉_(dá)量高于

5、花瓣、花萼和花絲。
　　 2，蘋(píng)果FT基因啟動(dòng)子的克隆及序列分析
　　 啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄水平上的一種重要調(diào)控元件，嚴(yán)格調(diào)控植物基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PCR技術(shù)從‘富士’蘋(píng)果中克隆了1條長(zhǎng)為1620 bp的基因組DNA序列，該序列含有3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子，編碼174個(gè)氨基酸，與蘋(píng)果FT同源基因有99％的同源性。采用基因組步移法克隆了FT基因的5'側(cè)翼序列1784 bp，拼接后的蘋(píng)果FT基因及啟動(dòng)子序列共3250 bp，命名為

6、MdFT-P（GenBank登錄號(hào)GQ148775）。用PLACE、PlantCARE在線(xiàn)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)工具分析表明：該序列含有5UTR Pyrichstretch序列和啟動(dòng)子的特定結(jié)構(gòu)，如TATA-box、CAAT-box等保證轉(zhuǎn)錄的精確起始和轉(zhuǎn)錄頻率。另外含有一些順式作用元件如ABRE、GARE-motif、CGTCA-motif、光響應(yīng)元件和一些其他的調(diào)控序列，由此推測(cè)蘋(píng)果MdFT-P基因的表達(dá)可能受ABA、GA、MeJA和光等因素的

7、調(diào)控。
　　 3，蘋(píng)果FT館動(dòng)子連接GUS基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)分析
　　 為了進(jìn)一步研究并驗(yàn)證蘋(píng)果FT基因啟動(dòng)子的功能和表達(dá)調(diào)控規(guī)律，根據(jù)已經(jīng)克隆的MdFT-P基因啟動(dòng)子序列（GenBank登錄號(hào)GQ148775），及其MdFT-P基因5'上游啟動(dòng)子序列不同元件的分布情況，設(shè)計(jì)5條PCR引物，并在其5'端分別引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增MdFT-P基因5'上游啟動(dòng)子的不同區(qū)段（-1～-167；-1～-

8、300；-1～-787；-1～-1102；-1～-1585），將擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后連接植物表達(dá)載體pYH4215，替代pYH4215載體35S：：GUS的35S啟動(dòng)子，構(gòu)建MdFT-P基因啟動(dòng)子不同區(qū)段連接GUS基因的植物表達(dá)載體。
　　 將MdFT-P基因不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子連接GUS基因的植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到煙草葉片中，經(jīng)GUS組織化學(xué)瞬時(shí)染色，結(jié)果表明5個(gè)缺失片段均具有啟動(dòng)子活性，隨著啟動(dòng)子區(qū)域的擴(kuò)大轉(zhuǎn)錄活性升高。通