六六六降解富集液的獲得、降解相關(guān)基因的克隆及脫氯酶基因的表達.pdf

1、中國是世界上農(nóng)藥生產(chǎn)和使用的大國，從1990年起農(nóng)藥生產(chǎn)量一直位于世界第2位，僅次于美國，已注冊登記投入使用的農(nóng)藥有效成分的品種約600多種，包括殺蟲劑、殺菌劑、除草劑、生物調(diào)節(jié)劑等。隨著科技的進步和農(nóng)業(yè)的發(fā)展，農(nóng)藥的品種和使用將也越來越大，會導致新的污染產(chǎn)生，尤其對于中國這樣一個農(nóng)業(yè)大國。環(huán)境有一定的自凈能力，但人類使用的農(nóng)藥量遠遠超過了其承受范圍，因此環(huán)境中的降解微生物的作用成為世界研究的熱點。但通過人工篩選出的微生物往往存在降解譜

2、窄，降解能力不強，對環(huán)境適應能力差等種種不足，因此通過克隆相關(guān)降解基因，構(gòu)建高效多功能基因工程菌和開發(fā)具有降解功能的酶制劑成為科學家們研究的新熱點。但降解微生物的篩選一直遵循著這樣一個程序：采樣；富集；純培養(yǎng)的分離；基因克??；酶學研究及基因工程菌構(gòu)建。這樣的基礎是必須獲得純培養(yǎng)，否則后續(xù)研究將無法深入。而且面對如此多的農(nóng)藥，要分離出針對每種農(nóng)藥的降解菌也是個浩大工程。現(xiàn)在的生態(tài)學研究結(jié)果表明，自然界可培養(yǎng)的微生物還不到自然界現(xiàn)有的1％，

3、因此要分離到每種農(nóng)藥降解菌也是不可能的。如何利用這些未知資源引起了研究者們的高度重視，這樣一個概念應運而生，即環(huán)境宏基因組研究，它將環(huán)境中的所有微生物的核酸提取出來并對其進行建庫，從中尋找人們需要的基因及其產(chǎn)物，大大提高了人們對資源的利用率，并不斷有新的發(fā)現(xiàn)。那么這一研究思路同樣也適合我們農(nóng)藥殘留降解的研究，從污染土壤或富集液中提取宏基因組，然后采用PCR或建基因組庫的方法克隆已知或未知基因，并結(jié)合分子生物學技術(shù)構(gòu)建工程菌，生產(chǎn)對人們有

4、用的降解酶，從而為生產(chǎn)和實際服務。 本研究獲得了六六六降解富集液，但一直未能獲得純培養(yǎng)，因此直接對富集液展開了初步研究，以期為農(nóng)藥殘留的降解開拓新途徑。具體研究內(nèi)容如下： 1.利用污染土壤進行富集馴化，獲得了能夠降解六六六四種異構(gòu)體的富集液，并利用發(fā)酵罐對其成功的進行了擴大培養(yǎng)，為富集液代替純培養(yǎng)用于生物修復提供了基礎。 2.根據(jù)報道的基因設計引物，成功的從富集液總DNA中獲得了降解六六六的相關(guān)基因。