southern northern western雜交應用

1、分子雜交分子雜交分子雜交是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白質分析方法，用于檢測混合樣品中特定核酸分子或蛋白質分子是否存在，以及其分子量大小。根據其檢測對象的不同可分為Southern雜交、Nthern雜交和Western雜交，以及由此而簡化的斑點雜交、狹線雜交和菌落雜交等。一、一、SouthernSouthernblottingblotting1轉膜當目標DNA經過限制性酶切并通過瓊脂糖凝膠電泳以后，在0.4NNaOH堿性條件下變性，再在

2、1.5MNaCl1MTris（pH7.4）條件下中和使DNA仍保持單鏈狀態(tài)。然后通過毛細管滲吸或電轉移或真空轉移的方式，將凝膠上的DNA轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上。最后通過80℃處理或紫外線照射將DNA固定在濾膜上。圖42是通過毛細管滲吸法進行Southernblotting的經典裝置圖。2分子雜交2.1預雜交將結合了DNA分子的濾膜先與特定的預雜液進行預雜交，也就是將濾膜的空白處用魚精DNA或牛奶蛋白封閉起來，防止在雜交過程中濾膜

3、本身對探針的吸附。2.2雜交在一定的溶液條件和溫度下，將標記的核酸探針與濾膜混合，如果濾膜上的DNA分子存在與探針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸附在濾膜上。2.3洗膜經過一定的洗滌程序將游離的探針分子除去。3檢測3.1放射性標記、檢測在分子克隆操作中用于標記核酸分子的標記物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S。在摻入核苷酸的標記過程中，只有三磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸鏈中，因此使用α位磷酸被標記的三磷酸核

4、苷酸，如[α32P]dATP。而在標記5末端磷酸基團的反應中一般使用γ位磷酸被標記的ATP。放射性的信號通過X光片放射自顯影或磷屏掃描獲取。有53外切活性。通過在待標記的DNA分子上產生切口，該酶引發(fā)53外切反應，在隨后的53DNA聚合反應中若存在標記的脫氧三磷酸核苷酸（dNTP），新合成的核酸鏈就帶有標記物。在整個標記反應體系中，待標記的DNA分子的任何一條鏈中的任何位點（除靠近5端外）都可能作為標記反應的起始點，并持續(xù)到該鏈的3末端

5、。因此，新合成的被標記的分子可以代表該待標記的DNA分子的絕大部分核苷酸序列。4.1.2隨機引物標記利用由6個核苷酸組成的序列隨機的寡核苷酸為引物，在Klenow酶的作用下對目標DNA進行隨機擴增。這樣擴增出來的DNA產物包括從任意某個位點（可能最靠近5的一些核苷酸除外）起始的單鏈DNA片段，其整體應該包含了目標DNA所有核苷酸序列信息。在擴增中加入標記的dNTP，擴增出來的DNA產物就可用作探針。該方法多用來標記一個DNA片段。4.1

6、.3PCR擴增標記在PCR擴增時加入標記的dNTP，不僅能對探針DNA進行標記還可進行大量擴增，尤其適合于探針DNA濃度很低的情形。4.2單鏈探針4.2.1單鏈DNA探針單鏈DNA探針是通過單鏈模板來制備的。首先將待標記的雙鏈DNA連接到M13噬菌體載體或噬菌粒載體上，制備其單鏈DNA然后以單鏈DNA為模板，以對應于載體上插入位點兩端序列之一的通用引物為引物，在有標記的dNTP存在下，通過KlenowDNA聚合酶合成單鏈DNA。經過分離

7、純化后即可得到高質量的帶標記的單鏈DNA探針。4.2.2單鏈RNA探針在有些質粒載體的多克隆位點兩端帶有噬菌體的啟動子，例如pGEM3和pBlueⅡ系列載體分別含有T7SP6噬菌體啟動子和T7T3噬菌體啟動子。將待標記的DNA片段插入載體的多克隆位點，在轉錄區(qū)下游選擇一個酶切位點，用限制性內切酶將載體線性化以防止轉錄出載體的序列和多聯(lián)體產物。加入對應的噬菌體RNA聚合酶，rNTP和某個標記的rNTP在體外進行轉錄，合成出標記的單鏈RNA

8、。利用無RNA酶活性的DNA酶處理以及后續(xù)純化步驟可獲得純化的單鏈RNA探針。單鏈RNA探針的制備不僅比單鏈DNA探針更容易，而且其產生的雜交信號更強。4.3末端標記直接將探針分子的某個原子替換為放射性同位素原子，或直接在探針分子上加入標記的原子或復合物，這種直接標記一般是在探針分子的末端進行標記，亦稱末端標。4.3.1DNA片段的末端標記末端標記主要通過酶促反應來完成，但標記的方式很多。如KlenowDNA聚合酶和T4或T7DNA聚合