western blot 相關(guān)試劑及步驟

1、WesternWesternBlotBlot蛋白測(cè)定步驟蛋白測(cè)定步驟三蒸水制備后需要高壓消毒一、組織的采集一、組織的采集（一）器材和試劑準(zhǔn)備：（一）器材和試劑準(zhǔn)備：鑷子、眼科剪、70%乙醇（三蒸水配制）、1.5mL離心管、液氮（二）步驟（以心臟為例）:1、脫頸椎處死小鼠，讀取小鼠編號(hào)2、乙醇消毒胸部，剪開(kāi)胸腔，剪下心臟（一顆心臟約100mg），排除血液，放入離心管，投入液氮中3、組織于80攝氏度凍存二、組織蛋白的提?。憾⒔M織蛋白的提取

2、：（一）器材和試劑準(zhǔn)備：（一）器材和試劑準(zhǔn)備：4mL離心管、15mL管、研磨機(jī)、鑷子、冰盒、離心機(jī)、RIPA蛋白裂解液（RadioImmunoprecipitationAssay，詳見(jiàn)下載的網(wǎng)頁(yè)）（碧云天公司）、PMSF（Phenylmethanesulfonylfluide，苯甲基磺酰氟，詳見(jiàn)下載的網(wǎng)頁(yè)prod號(hào)36978，ThermoScientific）、70%乙醇、三蒸水（二）步驟（二）步驟1、準(zhǔn)備好三管10mL70%乙醇、一管

3、三蒸水；取出RIPA和PMSF解凍2、按照1mLPIRA：10uLPMSF：100mg組織的比例，加試劑和組織于4mL離心管3、按照三管10mL70%乙醇、一管三蒸水的順序依次洗滌研磨鉆頭（每管5秒），再研磨組織，上下且圓周運(yùn)動(dòng)離心管。每管研磨的轉(zhuǎn)速和時(shí)間保持一致。當(dāng)出現(xiàn)大量泡沫時(shí)即可停止4、靜置于冰盒30分鐘5、12000rpm，4攝氏度，30分鐘6、先取100uL上清于離心管，再取300uL上清于離心管。前者用于測(cè)試，后者備用。80

4、攝氏度凍存。注意：購(gòu)置的RIPA不宜反復(fù)凍融，需分裝80攝氏度保存；PMSF為晶體狀，購(gòu)置后按照說(shuō)明書(shū)溶于異丙醇，分裝80攝氏度保存過(guò)硫酸銨0.1gdddH2O定容至1.0ml，4℃保存，要在一周內(nèi)使用，最好新鮮配制6）TEMED遮光保存，分裝于EP管凍存五、電泳五、電泳（一）器材和試劑準(zhǔn)備：（一）器材和試劑準(zhǔn)備：電泳儀、電磁鍋、浮板、離心機(jī)、1.5mL離心管、Marker、5上樣緩沖液（loadingbuffer）、生理鹽水、電泳液（

5、二）步驟（二）步驟1、電泳上樣體系總25uL（即每孔加25uL）：（下表的列表示凝膠孔一個(gè)孔所加的試劑）Marker管（泳道）蛋白樣品管（泳道）空白管（泳道）蛋白無(wú)？無(wú)5loadingbuffer5uL5uL5uLMarker7uL無(wú)無(wú)生理鹽水13uL補(bǔ)齊至25uL20uL體系總體積25uL25uL25uLMarker條帶依次是170、130、95、72（red）、55、43、34、26、17、10（green）KD大小的梯度。蛋白樣品

6、管的上樣量的計(jì)算：40ug（這個(gè)值不一定的，可以根據(jù)算出的體積來(lái)改變。比如超過(guò)20uL則需要減少上樣量。而且如果內(nèi)參不齊時(shí)也需要調(diào)整）除以依據(jù)分光光度計(jì)的讀數(shù)算出的蛋白濃度ugmL（根據(jù)說(shuō)明書(shū)蛋白以1：20被稀釋?zhuān)?，再轉(zhuǎn)換成uL的單位?？瞻坠艿脑O(shè)置是因?yàn)椋?dāng)?shù)鞍讟悠飞儆?個(gè)樣品時(shí)，空出的孔需要加入物質(zhì)，以免蛋白跑偏。2、根據(jù)上表加好各試劑后，于270攝氏度水浴5分鐘，離心，再上樣，倒入電泳液5SDSPAGE5SDSPAGELoading