northern blot注意事項(xiàng)

1、DIGDIG檢測(cè)試劑盒疑難問(wèn)題及解決方案檢測(cè)試劑盒疑難問(wèn)題及解決方案一、靈敏度低或信號(hào)弱的問(wèn)題及解決方案？1.探針標(biāo)記效率低：2.膜的問(wèn)題：使用陽(yáng)性尼龍膜3.雜交：增加標(biāo)記探針的濃度，或減少洗滌時(shí)的嚴(yán)謹(jǐn)性4.曝光時(shí)間：增加曝光時(shí)間；使用高靈敏度的專用化學(xué)發(fā)光的LumiFilm膠片，其他像KodakXAR也可。二、高背景解決方案1.探針標(biāo)記：純化的DNA或RNA在標(biāo)記前用乙醇沉淀；確認(rèn)探針對(duì)靶序列是特異性并跟其他載體無(wú)同源性；2.膜：推薦

2、使用羅氏或經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的膜(pall)、Ambion膜3.雜交：使用CDPStar發(fā)光底物，最好將DIG探針濃度稀釋到（RNA2050ngml）另外在雜交過(guò)程中不要讓膜干燥4.檢測(cè)過(guò)程：將抗DIGAP的酶的濃度到由原來(lái)的1:20000減少到1:50000，也不會(huì)減少酶檢測(cè)的靈敏度。增加洗脫和封閉的溶液的量和次數(shù)；膜上出現(xiàn)斑點(diǎn)可能是由于酶在膜上的凝集，需要將膜短暫離心后使用。5.曝光時(shí)間：縮短曝光時(shí)間，通常為1560s。DNA酶消化后去除模板

3、DNA。3PCR法：包括線性擴(kuò)增和不對(duì)稱PCR。線性擴(kuò)增PCR只使用單一引物，一定要去除未結(jié)合的核苷酸。不對(duì)稱PCR可使用上下游引物。但下游引物濃度更高有利于合成反義核苷酸?？墒褂肞CR或反轉(zhuǎn)錄PCR為模板。4.引物延伸法：二、雜交溫度的優(yōu)化1.RAN探針：在高溫68℃，高AT含量或與靶基因出現(xiàn)多個(gè)誤配的探針，可能雜交失敗。如果在此溫度信號(hào)較弱，盡量減少雜交和洗脫溫度至60℃.2.DNA探針：如果在42度有交叉反應(yīng)(非特異性帶)，則增加

4、溫度到4548℃.3.寡核苷酸探針有較低的Tm值，如果在37℃雜交信號(hào)弱或無(wú)信號(hào)則用等量的2.5SSC7%SDS稀釋雜交液再回復(fù)到3742℃雜交和洗脫。(二)條帶高背景的原因1.低于最適的雜交溫度：如DNA探針溫度為42℃，RNA探針為65℃，如低于此溫度會(huì)出現(xiàn)高背景或交叉反應(yīng)。雜交溫度需憑經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定2.探針濃度太高:如RNA探針濃度為0.1nMDNA化學(xué)標(biāo)記法濃度為1pM，內(nèi)部參入法為10pM，放射性標(biāo)記為106cpmmL.使用更高濃