免疫組化技術(shù)(原理、分類、步驟及主要試劑、設(shè)備準(zhǔn)備)

1、免疫組化技術(shù)業(yè)精于勤而荒于嬉行成于思而毀于隨華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院1免疫組化技術(shù)原理抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性及定量的研究。眾所周知，抗體與抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細(xì)胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫實驗動物，制備特異性抗體，再用這種

2、抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結(jié)合，形成抗原一抗二抗復(fù)合物，將抗原放大，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來（常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒）。通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細(xì)胞或組織中的化學(xué)成分，在顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞或組織原位確定某些化學(xué)成分

3、的分布、含量。組織或細(xì)胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進行檢測。分類（常用）1、免疫熒光方法最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分

4、析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應(yīng)用比較廣。2、免疫酶標(biāo)方法免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來的技術(shù)?；驹硎窍纫悦笜?biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前定位準(zhǔn)確、對比度好、染色標(biāo)本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。免疫酶標(biāo)方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)

5、衍生出了多種標(biāo)記方法，目前在病理診斷中廣為使用的當(dāng)屬PAP法（過氧化物酶抗過氧化物酶）、ABC法（卵白素生物素過氧化物酶復(fù)合物）、SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶）、即用型二步法（聚合物鏈接）等。3、免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學(xué)活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白

6、)等作為探針，就能對組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。4、免疫鐵蛋白法5、放射免疫自顯影法免疫組化技術(shù)業(yè)精于勤而荒于嬉行成于思而毀于隨華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院315、顯色：DAB顯色510min，在顯微鏡下掌握染色程度（胞

7、漿呈棕色者判定為陽性細(xì)胞）（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）（A：DABB：H2O2C：磷酸緩沖液）16、自來水沖洗10分鐘終止反應(yīng)17、復(fù)染：蘇木精復(fù)染2min，鹽酸酒精分化18、自來水沖洗1015min19、常規(guī)脫水、透明、封片（用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上）、鏡檢③結(jié)果分析：每張切片選擇5個高倍鏡視野（400X），應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進行定量灰度掃描后進行分析

8、。試劑、設(shè)備：1、PBS：0.01M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配制取NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4?12H2O3.63g或Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，溶于900ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至7.4，加水定容至1L，常溫保存?zhèn)溆谩?、固定液：4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配制–a.0.1M磷酸鹽緩沖液：取A液400ml與B液80ml混合后，調(diào)pH于7.4，再定容至500mlA液：0.1molLN

9、a2HPO4（Na2HPO4?12H2O35.8g加水定容至1000ml）B液：0.1molLNaH2PO4（NaH2PO4?2H2O15.6g加水定容至1000ml）b.4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液：取20g多聚甲醛溶于500ml0.1M磷酸鹽緩沖液中，加熱并攪拌約23h后溶解3、梯度酒精：100%、95%、80%、70%、50%4、二甲苯5、包埋劑：石蠟6、防脫劑：多聚賴氨酸（PLL5g蒸餾水1000ml）、APES（3氨丙基3乙氧基甲

10、硅烷）7、抗原修復(fù)液：0.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0），或0.01M檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）配制取A液8ml與B液42ml混合后加水至400ml，調(diào)pH于6.0，再定容至500mlA液：0.1molL檸檬酸（C6H8O7?H2O21.01g加水定容至1000ml）B液：0.1molL檸檬酸鈉（Na3C6H5O7?2H2O29.41g加水定容至1000ml）8、SP超敏免疫組化試劑盒（包括試劑A、B、C、D）試劑A阻斷劑：3%甲醇