免疫組化(immunohistochemistry)技術(shù)常見問題

1、免疫組化（Immunohistochemistry）技術(shù)常見問題1、一抗的選擇要點(diǎn)和技巧是什么？、一抗的選擇要點(diǎn)和技巧是什么？（1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆來產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親

2、和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。（2）應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于Westernblotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。（3）種屬反應(yīng)性的選擇（speciesreactivity）。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內(nèi)的抗原。（4）種屬來源，一般兔來源的

3、多是多克??；而小鼠來源的多是單克隆，但也有另外。根據(jù)此來源來選擇相應(yīng)的二抗。（5）生產(chǎn)廠家的選擇。不同廠家的同一種抗體它的實(shí)際效價(jià)穩(wěn)定是不同的。2、石蠟切片和冰凍切片的比較？、石蠟切片和冰凍切片的比較？（1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，這是今天我向一老師請教得出的結(jié)論。因?yàn)樽魇炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。（2）冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保

4、存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不需抗原修復(fù)這一步。缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當(dāng)你買一抗時(shí)，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。（3）石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在80度的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。

5、由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色形態(tài)都較冰凍切片好。3、在什么情況下使用、在什么情況下使用TritonX100（2）DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；（3）此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時(shí)間；（4）DAB顯色時(shí)間很長（

6、如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時(shí)間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過長。8、免疫組化結(jié)果如何分析？、免疫組化結(jié)果如何分析？（1）陽性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的10個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽性著色細(xì)胞，每組3~6張不同動物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。（2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用imagej進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)

7、計(jì)分析即可。（3）評分法。通過在光學(xué)顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進(jìn)行評分（1~4分為0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。對于以上這幾種方法，各有利弊，請細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。9、在什么情況下進(jìn)行組織抗原修復(fù)，抗原修復(fù)的條件是什么？、在什么情況下進(jìn)行組織抗原修復(fù)，抗原修復(fù)的條件

8、是什么？（1）由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。（2）修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。（3）微波修復(fù)，我們一般用6min4次，效果不錯(cuò)。10、內(nèi)源性過氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么？、內(nèi)源性過氧化物酶的滅活時(shí)間和濃