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1、基因組基因組DNASouthern雜交雜交1）基因組）基因組DNASouthern印跡的制備印跡的制備預(yù)備預(yù)備1用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化基因組DNA樣品（10μg）。2進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。一般用0.7～1.0％的瓊脂糖凝膠分離基因組DNA，它在1～15kb的范圍內(nèi)有較好的分辨率，可選用TBE或TAE緩沖液。瓊脂糖凝膠電泳需在1Vcm的電壓下進(jìn)行，如果要分離片段大小相似的DNA帶，應(yīng)用較大的凝膠（2025cm）。常用的標(biāo)準(zhǔn)品是由HindⅢ

2、消化的λDNA、HaeⅢ消化的ΦX174DNA和100或1000bp的梯形圖譜。電泳完畢，將凝膠放在紫外透射儀上，并在凝膠旁放一尺子進(jìn)行拍照。當(dāng)把凝膠從盤(pán)內(nèi)移動(dòng)紫外透射儀時(shí)，小心不要將凝膠滑落或弄破。Southern印跡的制備印跡的制備1將凝膠轉(zhuǎn)移至塑料盒內(nèi)。2加入至少4倍凝膠體積的0.25molLHCl使DNA脫嘌呤，置室溫?fù)u床溫育15min。這時(shí)凝膠上樣緩沖液中的溴酚藍(lán)應(yīng)變黃色，如果15min后仍呈藍(lán)色，應(yīng)再溫育5min。3小心地塑

3、料盒內(nèi)HCl棄去，用蒸餾水漂洗凝膠一次。4加入至少4倍體積的變性緩沖液，置室溫?fù)u床溫育20min。5用新鮮緩沖液重復(fù)步驟4，小心棄去變性緩沖液，用蒸餾水稍加漂洗。6加入至少4倍體積的中和反應(yīng)緩沖液，置室溫?fù)u床溫育15min。7用新鮮緩沖液重復(fù)步驟6。8當(dāng)處理凝膠時(shí)，裁一張略大于凝膠的濾膜（硝酸纖維膜或尼龍膜），預(yù)先用蒸餾水將濾膜浸濕后用20SSC浸泡至少15min。9安裝轉(zhuǎn)移裝置。在盤(pán)中加入印跡緩沖液（20SSC），在緩沖液面作一平臺(tái)，

4、比如可倒置一凝膠盤(pán)，上面蓋三張經(jīng)20SSC飽和過(guò)的濾紙（Whatman3MM），平臺(tái)兩側(cè)的濾紙應(yīng)浸泡在緩沖液中，用10ml的玻璃吸管在其表面小心滾動(dòng)以趕出所有氣泡，并將濾5在95℃10min使探針變性，立即置冰浴冷卻5min。6剪去雜交袋的一角，將預(yù)雜交液倒入15或50ml的Falcon試管中，將約10～20ngml（隨機(jī)引物標(biāo)記的）或50～100ngml（缺口平移法的）探針加到預(yù)雜交液或新鮮配制的雜交緩沖液中（如果打算用硫酸葡聚糖）。

5、一般來(lái)說(shuō)，106～107cpmml已足夠，輕輕混勻，用一次性的塑料移液管將雜交液加到塑料袋內(nèi)的濾膜上。7從開(kāi)角處將雜交液袋內(nèi)的氣泡全部擠出，用紙巾吸去流出的少許雜交液，小心封口以防雜交液漏出。必要的話，可將此雜交袋套在另一塑料袋中以防放射性污染。8在65℃水浴搖床中溫育或夾在兩塊玻璃板中置烤箱烘烤12～16h。9雜交后，剪去雜交袋的一角，擠出雜交混合液倒入15或50ml的Falcon管中，小心不要使放射性溶液濺出。10將雜交袋完全打開(kāi)，

6、用鈍頭鑷子將濾膜轉(zhuǎn)移至盤(pán)內(nèi)以便漂洗，立即用緩沖液1（2SSC，0.1％SDS）洗濾膜。11室溫下，用漂洗緩沖液1漂洗濾膜三次，每次5min。12室溫下，用漂洗緩沖液2（0.25SSC，0.1％SDS）漂洗濾膜兩次，每次5min。13在65℃用預(yù)熱的漂洗緩沖液2洗膜1～3次，每次15min。在更換緩沖液之間，應(yīng)用蓋革計(jì)數(shù)器檢測(cè)滯留在印跡中心的放射性（將印跡中心所期望的特異性信號(hào)與印跡邊緣所期望的本底信號(hào)相比較）。14充分漂洗后，將濾膜放在