棘胸蛙熱休克蛋白90相關(guān)基因的全長cDNA克隆與表達(dá)分析.pdf

1、熱休克蛋白是生物體受到應(yīng)激后產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)，對維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和細(xì)胞生存具有重要作用。棘胸蛙是我國重要的養(yǎng)殖蛙類，養(yǎng)殖過程中常受高溫及病原菌等方面的脅迫，造成養(yǎng)殖蛙類的死亡，嚴(yán)重影響了我國蛙類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究采用同源克隆策略及RACE技術(shù)，克隆了棘胸蛙HSP90及GRP94基因的全長cDNA序列，利用實時熒光定量方法研究了棘胸蛙在高溫、嗜水氣單胞菌以及poly(I∶C)脅迫情況下，HSP90基因和GRP94基因的不同組織表達(dá)情況，

2、并對其結(jié)果進(jìn)行分析與討論。
　　本實驗采用同源克隆策略和RACE技術(shù)，克隆出了棘胸蛙HSP90基因和GRP94基因的全長cDNA序列:(1)其中棘胸蛙HSP90基因cDNA全長為2801 bp，開放閱讀框(ORF)序列長度為2172 bp，編碼724個氨基酸，5'非編碼區(qū)序列為65 bp，3'非編碼區(qū)序列為564 bp，GenBank登錄號為(KT970674)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列有5個HSP90蛋白家族標(biāo)簽氨基酸序列，且

3、在序列C末端具有一個典型的HSP90蛋白共有的MEEVD保守序列。同源比對分析顯示，棘胸蛙HSP90基因與非洲爪蟾的相似性最高，為94％。進(jìn)化樹分析顯示棘胸蛙HSP90蛋白首先與兩棲類聚在一起。(2)棘胸蛙GRP94基因cDNA全長為3179 bp，開放閱讀框(ORF)序列長度為2448 bp，編碼816個氨基酸，5'非編碼區(qū)序列為113 bp，3'非編碼區(qū)序列為618 bp。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列有一個HATPase-c結(jié)構(gòu)域。同

4、源比對分析顯示，棘胸蛙GRP94基因與非洲爪蟾的同源性最高，為85％。進(jìn)化樹分析顯示棘胸蛙GRP94蛋白首先與兩棲類聚在一起。
　　熒光定量結(jié)果顯示棘胸蛙HSP90基因在肝臟、心臟、肺、胃、腸、腎臟、肌肉、血液、皮膚和脾臟中都有表達(dá)，其中皮膚、肝臟、腎臟和腸道表達(dá)量較高，心臟、肺、胃、血液中表達(dá)量相對較少，肌肉中表達(dá)最少;棘胸蛙GRP94在皮膚中表達(dá)量最高，其次是肝臟、腎臟和腸道，表達(dá)量最低的是肌肉組織。
　　通過30℃高溫

5、脅迫試驗表明，HSP90基因在棘胸蛙皮膚、肝臟和腎臟組織中的表達(dá)量顯著增高，其中皮膚3h時表達(dá)量最高，肝臟和腎臟6h時表達(dá)量最高，隨著時間的推移表達(dá)量逐漸降低;GRP94基因在棘胸蛙皮膚、肝臟和腎臟組織中的表達(dá)量顯著增高，都在6h時表達(dá)量最高。隨著時間的推移表達(dá)量逐漸降低。
　　通過腹腔注射嗜水氣單胞菌試驗表明，HSP90基因和GRP94基因在棘胸蛙肝臟和腎臟組織中的表達(dá)量顯著增高，24h時表達(dá)量達(dá)到最高值，隨著時間的推移表達(dá)量逐