馬氏珠母貝熱休克蛋白與Toll樣受體基因的克隆與表達研究.pdf

1、本研究以馬氏珠母貝(Pinctada martensii)為研究對象,利用本實驗室構建的珍珠囊轉錄組和植核后6個時期珍珠囊的數(shù)字基因表達譜數(shù)據(jù)庫。從中篩選出熱休克蛋白基因和Toll樣受體基因的Unigene片段。應用cDNA末端快速擴增(RACE)技術從馬氏珠母貝外套膜中克隆了熱休克蛋白60基因（PmHSP60)、熱休克蛋白90基因(PmHSP90)、Toll樣受體4基因(PmTLR4)、Toll-like protein基因(PmTL

2、P)的cDNA序列全長,對其進行了生物信息學分析。并分析了四個基因的組織表達及在應激后不同時間點的表達。結果如下:
　　1.四個免疫基因cDNA全長的獲取及其序列分析:PMHSP60基因cDNA全長為2495 bp,開放閱讀框為1734 bp。PmHSP90基因cDNA全長為2584 bp,開放閱讀框為2160 bp,編碼719個氨基酸。PmTLR4基因cDNA全長3138 bp,開放閱讀框2697 bp,編碼899個氨基酸。Pm

3、TLP基因cDNA全長為2214 bp,其中開放閱讀框為2043 bp,編碼681個氨基酸。同源性比對分析發(fā)現(xiàn),PmHSP60和PmHSP90與其他軟體動物的序列具有高度同源性,PmHSP60與光滑雙臍螺的相似度最高,達78％。PmHSP90基因與太平洋牡蠣的序列相似性達89%;而PmTLR4和PmTLP基因與其它物種的相似度較低,PmTLR4與地中海貽貝的Toll樣受體f前體的相似度最高,為34%。PmTLP與太平洋牡蠣toll pr

4、otein和TLR6的序列相似性分別為為38%和32%。氨基酸序列分析顯示:PmHSP60氨基酸序列具有典型的mt-HSP60特征序列、C-末端典型的GGM重復基序和一個ATP結合結構域;PmHSP90具有HSP90家族典型的五個特征基序:NKEIFLRELISN[A/C/S]SDALDKIR,LGTIA[K/R] SGTIG QFGV GFYSAYLVA[E/D],IKLYVRRVFI,GVVDSEDLPLNISRE和C端的MEEVD

5、;PmTLR4和PmTLP具有Toll樣蛋白家族典型的TIR結構域和LRR結構域。
　　2.四個基因的組織差異表達分析:以GAPDH基因為內參基因,應用Real-time PCR技術,研究了PmHSP60、PmHSP90、PmTLR4和PmTLP四個免疫基因在馬氏珠母貝閉殼肌、外套膜、血淋巴、肝胰腺、性腺和鰓等6個組織中的表達變化。分析表明這4個免疫基因在各組織中均有表達,且在肝胰腺和鰓中有較高水平的表達,而在閉殼肌等非免疫組織中

6、表達量較低。
　　3.在三種應激(即脂多糖刺激、植核育珠移植耐受應激、熱刺激)條件下,四個基因的時序表達模式。脂多糖(LPS)刺激后,4個免疫基因均出現(xiàn)明顯上調。其中,PmHSP60在LPS注射后6 h達到最大表達量,而另外3個免疫基因PmHSP90、PmTLR4和PmTLP相對表達趨勢相似,均在3 h表達量達到最高水平。總的來說,這4個免疫相關基因都能夠響應LPS刺激,這些基因的表達譜特點是快速響應而后逐步下降;在植核后的不同時

7、期,PmHSP60在植核后0-1 d出現(xiàn)短暫的上調,隨后出現(xiàn)下調,并在第3 d出現(xiàn)回升,并在第5 d表達水平達到最高,而PmHSP90和PmTLR4在植核后的0-2d就出現(xiàn)明顯的上調,并都在第2 d表達量達到最大;熱脅迫下,貝血淋巴組織中的HSP60和HSP90 mRNA表達量有明顯的提高。PmHSP60 mRNA表達水平熱刺激后的12 h達到最大表達量,是空白對照組(0 h)的12.28倍(P<0.05);而PmHSP90在熱刺激后3

8、 h表達量達到最大,是空白對照組的28.89倍(P<0.05)。
　　4.PmHSP60的原核表達:構建了pET28-HSP60的原核表達載體,在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中用IPTG誘導表達得到大小為約61.79 kDa的蛋白條帶,并對表達溫度、誘導濃度和誘導時間進行優(yōu)化。在37℃,10 h和0.1 mM的IPTG濃度條件下重組蛋白的可溶性表達量最高。
　　綜上所述,本論文的研究結果為探討馬氏珠母貝免疫防御相