大珠母貝、珠母貝和草莓海菊蛤基因克隆與一達分析.pdf

1、大珠母貝(Pinctadamaxima)和珠母貝(P.margaritifera)隸屬于軟體動物門(Mollusca)，雙殼綱(Bivalvia)，珍珠貝目(Pterioida)，珍珠貝科(Pteriidae)，珠母貝屬(Pinctada)。大珠母貝俗稱白碟貝，主要分布于我國的海南省、雷州半島及澳大利亞、東南亞沿岸海域，屬熱帶、亞熱帶海洋的雙殼貝類，是生產(chǎn)海水珍珠的最大貝類，所產(chǎn)珍珠為聞名遐邇的南洋珠，是最名貴的珠寶。珠母貝俗稱黑蝶貝，

2、分布于太平洋和印度洋的熱帶海域，我國海南島、雷州半島和臺灣沿海亦有分布，該貝能育出世界上罕見的黑珍珠，也是目前唯一能批量生產(chǎn)黑珍珠的貝類。草莓海菊蛤(Spondylusfragum)隸屬于軟體動物門(Mollusca)，雙殼綱(Bivalvia)，珍珠貝目(Pterioida)，海菊蛤科(Spondylidae)，海菊蛤?qū)?Spondylus)，分布于菲律賓以及中國大陸的廣東、海南等地，常見于淺海及潮間帶低潮線附近的巖石及珊瑚礁上。該物

3、種的模式產(chǎn)地在菲律賓。本研究：(一)、克隆了大珠母貝Prismalin-14cDNA(pmaxPrismalin-14)序列及其3’端基因組序列，并對其進行了序列結(jié)構(gòu)分析和組織表達分析，對比了大珠母貝和合浦珠母貝(P.fucata)Prismalin-14蛋白的碳酸鈣沉降抑制效果并探究了其原因；(二)、克隆了珠母貝組織蛋白酶D(CathepsinD，CD)全長cDNA，命名為pmarCD，并對其進行了序列分析和組織表達分析；(三)、克隆

4、了草莓海菊蛤α-淀粉酶(α-amylase)全長cDNA，命名為sfAMY，并對其進行了序列分析和組織表達分析。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.利用已知大珠母貝EST文庫擴增得到大珠母貝Prismalin一14cDNA序列，該序列全長379bp，包括5’非編碼區(qū)(UTR)24bp，3’非編碼區(qū)(UTR)13bp，開放閱讀框(ORF)339bp，編碼由113個氨基酸組成的多肽，推測分子量約為12.7kDa，理論等電點為4.239，其

5、N-端的16個氨基酸肽段為信號肽。
　　 2.選取編碼大珠母貝pmaxPrismalin-14基因的ORF序列插入pET-32a質(zhì)粒構(gòu)建表達載體，通過IPTG誘導(dǎo)，親和層析柱純化，成功獲得預(yù)期大小的融合蛋白。碳酸鈣沉淀抑制實驗表明大珠母貝的pmaxPrismalin-14蛋白同樣具有抑制碳酸鈣沉淀的功能。
　　 3.組織特異性表達表明大珠母貝pmaxPrismalin-14基因在外套膜的表達遠高于其它組織，對大珠母貝外套

6、膜三個不同部位的熒光定量PCR表明，pmaxPrismalin-14基因在大珠母貝外套膜邊緣表達最高，外套膜皮質(zhì)部和外套膜中心表達較低。
　　 4.利用RT-PCR和PACE技術(shù)克隆了珠母貝pmarCD基因，該序列全長1840bp，5'非編碼區(qū)(UTR)長151bp，3‘非編碼區(qū)(UTR)長516bp，開放閱讀框(ORF)長1170bp，編碼390個氨基酸，推測分子量為42.18kDa，理論等電點為6.354，存在轉(zhuǎn)錄終止序列A

7、ATAAA和polyA尾，其N-端的18個氨基酸肽段為信號肽序列。組織表達顯示pmarCD基因在各個組織中均有表達，在性腺和肝胰臟中的有較高表達。
　　 5.利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了草莓海菊蛤sfAMY基因，該序列全長1717bp，5'非編碼區(qū)長89bp，3‘非編碼區(qū)長98bp，開放閱讀框(ORF)長1527bp，編碼509個氨基酸，推測分子量為56.98kDa，理論等電點為7.484，存在轉(zhuǎn)錄終止序列AATAAA和