馬氏珠母貝精子質(zhì)量檢測(cè)方法的研究.pdf

1、本文選用臺(tái)盼藍(lán)及熒光染料對(duì)馬氏珠母貝(Pinctada martensii)精液進(jìn)行染色,通過(guò)顯微鏡觀察比較染色效果,篩選出適宜馬氏珠母貝精子質(zhì)量檢測(cè)的染色方法,使之應(yīng)用于其精子質(zhì)量評(píng)價(jià)中所需的精子活率、質(zhì)膜完整性和DNA完整性等指標(biāo)的檢測(cè)中,也為貝類精子的質(zhì)量檢測(cè)提供最基礎(chǔ)的參考數(shù)據(jù)。
　　 1、臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)馬氏珠母貝活精率的研究。
　　 本文采用臺(tái)盼藍(lán)染色法對(duì)馬氏珠母貝活精率進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后,

2、在顯微鏡下可以明顯區(qū)分死活精子?；罹硬恢?呈透明狀；死精子變大著藍(lán)色。通過(guò)對(duì)該染料不同的染色濃度和染色時(shí)間的比較得出,臺(tái)盼藍(lán)最適的染色濃度為0.2％(終濃度)、染色時(shí)間為15 min。
　　 配制含有不同死亡率的9個(gè)樣品(10～90％)作為理論死亡率,用0.2％的臺(tái)盼藍(lán)和0.04％曙紅Y(終濃度)同時(shí)檢測(cè)上述各樣品。結(jié)果顯示,兩種染料檢測(cè)得出實(shí)際死亡率與理論死亡率呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),同時(shí)兩種染色方法的結(jié)果之間亦呈

3、極顯著正相關(guān)(P<0.01)。
　　 用臺(tái)盼藍(lán)和曙紅Y檢測(cè)了染料對(duì)精子的毒性作用以及室溫(28℃)放置下精子的自然死亡率。結(jié)果顯示,當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間積累后,兩種染料對(duì)精子都有一定的毒性作用,但是在45 min之內(nèi),毒性作用不明顯。
　　 上述各實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用0.2％的臺(tái)盼藍(lán)染色15 min可準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)馬氏珠母貝精子的存活率,能較真實(shí)的反映精子的狀態(tài)。
　　 2、二乙酰熒光素(Fluorescein diac

4、etate,FDA)-碘化丙錠(Propidium iodide,PI)雙熒光復(fù)染法檢測(cè)馬氏珠母貝精子活精率的研究。
　　 本文通過(guò)兩種熒光染料FDA和PI的聯(lián)用在熒光顯微鏡下檢測(cè)馬氏珠母貝精子的活率。通過(guò)不同的染色濃度和染色時(shí)間的比較發(fā)現(xiàn),FDA和PI的最適染色濃度均為10 ug/mL,染色時(shí)間控制在10 min之內(nèi)為宜。
　　 用新鮮精液和水浴致死的精液配制含有不同死亡率的5個(gè)樣品(0％、20％、40％、60％和80

5、％),作為理論死亡率,用FDA和PI測(cè)定各樣品精子的死亡率,并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示,熒光探針FDA和PI能分別標(biāo)記活精子和死精子,活精子發(fā)出綠色熒光,死精子發(fā)出紅色熒光。各樣品實(shí)測(cè)精子死亡率和理論死亡率之間呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。且染料FDA和PI加入精液的順序?qū)哟婊盥实臋z測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響(P>0.05)；表明FDA-PI雙熒光復(fù)染法是一種靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確有效的檢測(cè)馬氏珠母貝精子存活率的實(shí)驗(yàn)室方法。
　　

6、用FDA和PI檢測(cè)了超低溫冷凍前后精子的活精率。結(jié)果顯示,精液經(jīng)超低溫冷凍后精子的存活率明顯降低(P<0.01),質(zhì)膜受到不同程度的損傷。同時(shí)探討了不同的冷凍保存體積對(duì)馬氏珠母貝精子存活率的影響,結(jié)果顯示,體積過(guò)大或過(guò)小都會(huì)影響精子的存活率,冷凍時(shí)最佳的保存體積為1.2-1.6 mL。
　　 3、吖啶橙(Acridine Orange,AO)染色法檢測(cè)馬氏珠母貝精子DNA的完整性。
　　 本文用AO染色來(lái)檢測(cè)馬氏珠母貝精

7、子DNA的完整性。結(jié)果顯示,精液經(jīng)AO染色后,在熒光顯微鏡下可觀察到發(fā)出綠色熒光、紅色熒光或橘黃色熒光的精子,其中發(fā)綠色熒光的精子DNA雙鏈結(jié)構(gòu)完整,發(fā)紅色或橘黃色熒光的精子DNA雙鏈已受到不同程度的損傷,DNA雙鏈結(jié)構(gòu)已斷裂為單鏈。通過(guò)不同染色濃度和時(shí)間的比較發(fā)現(xiàn),最適的AO染色濃度為200 ug/mL,染色時(shí)間為5 min。在此基礎(chǔ)上,用AO染色法檢測(cè)評(píng)價(jià)超低溫冷凍前后精子DNA的完整性。結(jié)果顯示,冷凍對(duì)精子的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)會(huì)有不同