馬氏珠母貝富硒蛋白的生物構(gòu)建及抗氧化活性初探.pdf

1、馬氏珠母貝(Pinctada martensii)肉作為我國(guó)南方海水珍珠生產(chǎn)過(guò)程中的的副產(chǎn)品，除直接鮮食外一般作為飼料或棄于周邊，利用率低，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境。隨著人們對(duì)硒及其生物功能研究的逐步深入，有機(jī)硒作為安全有效的硒源已受到廣泛的關(guān)注，并有研究表明水生生物的硒蛋白組比陸生生物大，因此硒蛋白種類(lèi)較為豐富，是很好的有機(jī)硒源。目前水生生物富硒產(chǎn)品多以藻類(lèi)為主，但藻類(lèi)的生物量小，限制了富硒產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)及利用，而關(guān)于馬氏珠母貝的富硒及食物鏈

2、富硒的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以扁藻和馬氏珠母貝為原料，探討了食物鏈富硒的可能性，構(gòu)建了通過(guò)食物鏈培育富硒馬氏珠母貝的生物流程，并對(duì)富硒馬氏珠母貝硒蛋白進(jìn)行分離純化，以了解硒在馬氏珠母貝不同蛋白組分內(nèi)的分布，通過(guò)建立乳鼠心肌細(xì)胞的H2O2氧化模型，初步探討了馬氏珠母貝含硒蛋白的抗氧化活性，以期為馬氏珠母貝硒蛋白的進(jìn)一步分離純化和利用提供依據(jù)和基礎(chǔ)。
　　本文的主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下：
　　1.以不同濃度的硒處理扁藻培養(yǎng)基，分別采

3、用紫外分光光度計(jì)、氫化物原子熒光光譜法、凱氏定氮法以及考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定扁藻的生物量、藻粉中硒含量、藻粉中的蛋白質(zhì)含量和扁藻粗蛋白的蛋白質(zhì)含量，從而觀察不同硒濃度對(duì)扁藻生長(zhǎng)情況和扁藻富硒能力的影響。結(jié)果表明，硒對(duì)扁藻生長(zhǎng)的96h-EC50為33.65mg/L，硒對(duì)扁藻生長(zhǎng)的促進(jìn)濃度范圍為4.8~10.4mg/L，22.9mg/L以上硒濃度則會(huì)抑制甚至完全抑制扁藻的生長(zhǎng)；扁藻的富硒能力與培養(yǎng)液初始硒濃度呈正相關(guān)，硒濃度大于10.4mg/L時(shí)

4、，扁藻硒含量明顯增高，為普通扁藻的110~187倍，其中5.56％的硒與蛋白質(zhì)相結(jié)合存在，綜合考慮所得扁藻的生物量及硒含量，確定富硒扁藻的最佳處理?xiàng)l件為：初始硒濃度10.4mg/L，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為7d。
　　2.以所得的富硒扁藻投喂馬氏珠母貝，采用氫化物原子熒光光譜法、凱氏定氮法、和考馬斯亮藍(lán)法分別測(cè)定馬氏珠母貝肉及不同部位的硒含量、馬氏珠母貝肉的蛋白質(zhì)含量和粗蛋白中的蛋白質(zhì)含量，以檢測(cè)不同投喂時(shí)間對(duì)馬氏珠母貝富硒能力的影響。結(jié)果表明

5、，富硒馬氏珠母貝的最佳培養(yǎng)條件為：富硒藻粉投喂量1g/L，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為10d；硒在馬氏珠母貝的內(nèi)臟團(tuán)、外套膜和壁殼肌中均有分布，且含量依次降低；馬氏珠母貝中的蛋白結(jié)合硒占總硒的14.00%，為扁藻的2.5倍，說(shuō)明通過(guò)食物鏈傳遞，硒與蛋白的結(jié)合率有了明顯的提高。
　　3.用 Tris-HCl緩沖液對(duì)富硒馬氏珠母貝蛋白進(jìn)行提取，并通過(guò)等電點(diǎn)測(cè)定、(NH4)2SO4分步鹽析、Sephadex G-75柱層析及SDS-PAGE電泳分析對(duì)硒蛋

6、白進(jìn)行初步分離純化，以探討硒在不同蛋白組分內(nèi)的分布和主要硒蛋白的分子量范圍。結(jié)果表明，富硒馬氏珠母貝堿溶性蛋白的等電點(diǎn)初步確定處于pH3.9左右。B組蛋白，即40%(NH4)2SO4飽和度下的蛋白組分中硒含量最高，為77.69mg/kg pro；其次是20%和100%飽和度下的蛋白組分，硒含量分別為71.64mg/kg pro和70.98mg/kg pro；B組蛋白經(jīng)Sephadex G-75柱進(jìn)行分離后共出現(xiàn)3個(gè)蛋白峰，峰2的硒蛋白含

7、量最高，為554.35mg/kg pro；峰2中蛋白的分子量大約分布在200、97、44及35kD左右。
　　4.試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建乳鼠心肌細(xì)胞H2O2氧化損傷模型，對(duì)心肌細(xì)胞MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性進(jìn)行檢測(cè)，從而觀察富硒馬氏珠母貝含硒蛋白對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果表明，富硒馬氏珠母貝含硒蛋白可以降低 H2O2誘導(dǎo)氧化損傷心肌細(xì)胞的MDA含量，抑制心肌細(xì)胞SOD和GSH-Px活性的下降，從而起到對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的