大珠母貝金屬硫蛋白cDNA序列克隆與表達(dá)研究.pdf

1、大珠母貝（Pinctada maxima）是生產(chǎn)海水大型優(yōu)質(zhì)珍珠最理想的育珠貝。自1985年以來，大珠母貝苗種養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，特別是5cm左右的幼貝很難在海區(qū)養(yǎng)成；同時(shí)，由于人工濫捕，大珠母貝野生資源日漸稀少，已瀕臨絕種的危險(xiǎn)，大珠母貝養(yǎng)殖業(yè)出現(xiàn)了前所未有的困境，嚴(yán)重影響著我國(guó)珍珠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。然而大珠母貝死亡的原因尚不清楚，而水體的污染可能是因素之一。因此，開展污染因子對(duì)大珠母貝幼貝的影響研究，對(duì)探討大珠母貝的死亡原因、改良

2、種質(zhì)，實(shí)現(xiàn)大珠母貝養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
　　 金屬硫蛋白（MT）是一類普遍存在于生物體內(nèi)、分子量低、半胱氨酸含量豐富、能夠與二價(jià)重金屬離子結(jié)合的蛋白質(zhì)。金屬硫蛋白在清除自由基、解除重金屬毒性、參與體內(nèi)微量元素代謝、防止細(xì)胞癌變等方面具有重要作用。本研究從大珠母貝cDNA文庫(kù)中分離、克隆得到大珠母貝金屬硫蛋白基因（PMMT），開展了原核表達(dá)研究，并研究了鎘離子的急性毒性表達(dá)規(guī)律，以闡明金屬硫蛋白的作用機(jī)理和激活途徑

3、，探討它在大珠母貝應(yīng)激反應(yīng)和免疫防御保護(hù)過程中的作用，為研究大珠母貝的免疫防御體系，培育抗病抗逆的大珠母貝優(yōu)質(zhì)品種奠定基礎(chǔ)。
　　 1.從大珠母貝外套膜cDNA文庫(kù)中克隆獲得了大珠母貝金屬硫蛋白的全長(zhǎng)cDNA序列，長(zhǎng)599bp，5’非翻譯區(qū)（UTR）為75bp，3’UTR為296 bp，開放閱讀框（ORF）為228bp，編碼75個(gè)氨基酸。其中半胱氨酸含量豐富，達(dá)29.3％；賴氨酸和甘氨酸含量也較高，均為9.3％；不含苯丙氨酸、組

4、氨酸、色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸。
　　 2.氨基酸序列特征分析發(fā)現(xiàn)，大珠母貝金屬硫蛋白富含Cys-X（1-3）-Cys結(jié)構(gòu)，其中含有9個(gè)Cys-X-Cys結(jié)構(gòu)：CRC，CAC，CCC，CQC，CKC，CAC，CGC，CNC，CSC；2個(gè)Cys-X-X-Cys結(jié)構(gòu)：CPNC，CTDC；4個(gè)Cys-X-X-X-Cys結(jié)構(gòu)：CTDAC，CGDNC，CKVKC，CGVGC；同時(shí)還有個(gè)2個(gè)Cys-Cys結(jié)構(gòu)。大珠母貝金屬硫蛋白的CCC

5、XXXCXCX（X為除半胱氨酸以外的其他氨基酸）與無脊椎動(dòng)物金屬硫蛋白的特征序列（CKCXXXCXCX）極為相似，只相差1個(gè)氨基酸。大珠母貝金屬硫蛋白末端保守序列為CgCgvgCTTlsdCnCt-dCsCK，與軟體動(dòng)物的金屬硫蛋白末端保守序列CxCxxxCTGxxxCxCxxxCxCK基本相似，只是CTT代替了CTG。該序列具備金屬硫蛋白的典型特征，是金屬硫蛋白家族的成員。根據(jù)1999年Binz金屬硫蛋白分類方法可將該金屬硫蛋白歸為F

6、maiy2：mollusc MTs，subfamily mo：other mollusc MTs。大珠母貝金屬硫蛋白基因的克隆為深入研究金屬硫蛋白家族的進(jìn)化以及海洋貝類金屬硫蛋白的多樣性，理解其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.構(gòu)建了金屬硫蛋白的原核表達(dá)載體pET-32a-PMMT，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了大珠母貝金屬硫蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，為進(jìn)一步開展生物活性和功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.根據(jù)所獲得的cDNA

7、序列設(shè)計(jì)一對(duì)RT-PCR引物，用半定量RT-PCR的方法在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)了大珠母貝幼貝在不同濃度鎘離子刺激下金屬硫蛋白基因的表達(dá)情況。在未受鎘離子刺激的空白組可檢測(cè)到金屬硫蛋白基因的表達(dá)。在低濃度鎘離子刺激下（0.005mg/L），大珠母貝金屬硫蛋白表達(dá)量有所增加，為空白組1.70倍，至中高濃度組（0.05mg/L、0.1mg/L），這一比值分別增加到了1.79和2.08倍，說明鎘離子能夠誘導(dǎo)大珠母貝金屬硫蛋白基因的表達(dá)，表達(dá)水平隨鎘離