黃顙魚金屬硫蛋白cDNA克隆及原核表達(dá).pdf

1、金屬硫蛋白普遍存在于生物體內(nèi)，具有低分子量、富含半胱氨酸、誘導(dǎo)性強等特點。金屬硫蛋白具有很強的金屬結(jié)合能力和氧化還原能力，在生物體內(nèi)參與細(xì)胞內(nèi)金屬水平的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、重金屬解毒、清除自由基、抵抗電離輻射等，具有較強的生物學(xué)功能。
　　 本論文通過同源克隆和RACE等方法克隆了黃顙魚MT全長cDNA序列。該序列全長381kb，開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)長度為183bp，可以編碼60個氨基酸，推導(dǎo)的氨基酸

2、序列與其他已知魚類MT具有80％以上的相似性(identity)，序列比對和聚類分析表明黃顙魚MT與斑點叉尾鮰MT氨基酸序列相似性最高(91%)。理論分子量為6080Da。在其編碼的氨基酸序列中半胱氨酸(Cys)含量最高，占33.3%，其次是絲氨酸(Ser)占18.3%，賴氨酸(Lys)占11.67%，不含組氨酸和芳香族氨基酸。對其編碼的氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)該序列有脊椎動物金屬硫蛋白的保守序列模式cys-x-cys、cys-x-xcy

3、s和cys-x-cys-cys。在半定量試驗中，用β-actin基因做內(nèi)參，用比較電泳條帶亮度比值得方式進行分析，表明MT會受到Cd2+的誘導(dǎo)表達(dá)并與其濃度相關(guān)，MT在肝臟中表達(dá)量相對較高。
　　 本論文采用基因重組技術(shù)，將黃顙魚MT基因重組入原核表達(dá)載體pMAL-c2x中，該載體含有一個麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)基因，便于融合蛋白表達(dá)后的純化。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Ecoli BL21中進行體外表達(dá)，SDS-PAGE分析表明，經(jīng)IPTG