重組人金屬硫蛋白MT-2a的原核表達(dá)、純化及其功能研究.pdf

1、金屬硫蛋白(Metallothionein,MT)是一類低分子量、富含半胱氨酸、無芳香族氨基酸和組氨酸、能與金屬結(jié)合的普遍存在于生物界的非常獨(dú)特的蛋白質(zhì)。人類的MT 分為4個(gè)組分：MT-l、MT-2、MT-3、MT-4。這些組分又可分為10個(gè)有功能的亞型和7個(gè)無功能的亞型。MT-2a是MT-2組分中唯一具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。研究表明，MT-2a不僅具有重金屬解毒、清除自由基、抗輻射、修復(fù)組織損傷、抗衰老以及調(diào)節(jié)微量元素平衡等重要作用，

2、還與細(xì)胞的增殖與凋亡、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤耐藥等密切相關(guān)。因此，對(duì)MT的研究不僅具有重要的理論意義，而且具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。為了深入研究MT的生物學(xué)功能并開發(fā)這一產(chǎn)品，許多學(xué)者從動(dòng)物肝臟中直接提取MT，但該制備方法成本昂貴，耗時(shí)費(fèi)力，且無法獲取人源性的MT蛋白，而基因重組方法能克服這些缺陷，使大量制備及純化MT蛋白成為可能。 本研究采用RT-PCR方法擴(kuò)增人MT-2a基因的完整編碼區(qū)，重組至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1，在大

3、腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST-MT-2a并進(jìn)一步純化。首先，通過正交設(shè)計(jì)找到可溶性融合蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，即在細(xì)菌OD<,600>為0.7～0.9時(shí)加入終濃度為0.05 mmol／L的IPTG，于30℃誘導(dǎo)表達(dá)8 h。經(jīng)親和層析純化后，每升菌液中可得到可溶性GST-MT-2a融合蛋白的產(chǎn)量約為38 mg。融合蛋白經(jīng)過PreScission Protease酶切，獲得純度為97.9％的重組人MT-2a蛋白，每升菌液產(chǎn)量約為5 mg。

4、其次，以可溶性融合蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔制備抗血清，產(chǎn)生針對(duì)MT-2a的雙向免疫擴(kuò)散效價(jià)>1:256，ELISA效價(jià)>1×10<'-6>的兔抗血清；Western blot證明其特異性良好，可用于真核細(xì)胞中MT-2a表達(dá)的檢測(cè)。再次，對(duì)重組蛋白進(jìn)行功能鑒定：純化的重組人MT-2a蛋白經(jīng)原子吸收光譜法測(cè)定，每1分子重組人MT-2a蛋白可結(jié)合7個(gè)左右的鋅離子，羥自由基測(cè)定試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的清除羥自由基能力，為還原型谷胱苷肽的1