大豆蚜熱休克蛋白70基因的克隆、原核表達(dá)與定量分析.pdf

1、熱休克蛋白Hsps(Heat shock proteins)是一類極度保守的應(yīng)激蛋白，廣泛地參與細(xì)胞的保護。目前，Hsp70家族被廣泛認(rèn)為是最為保守和重要的熱休克蛋白家族。在脅迫環(huán)境下，如重金屬、低氧、高溫、饑餓、病原的入侵等的刺激下，Hsp70的表達(dá)量顯著增加。熱休克蛋白的高度表達(dá)能增強昆蟲對外界脅迫因子的抵御能力，對昆蟲機體維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和正常新陳代謝有著非常重要的作用。通過分子生物學(xué)技術(shù)使害蟲熱休克蛋白的表達(dá)量降低，來減弱有

2、害昆蟲對外界不利環(huán)境的防御能力，從而達(dá)到協(xié)助殺滅害蟲的目的。通過分子生物學(xué)技術(shù)使害蟲熱休克蛋白的表達(dá)量降低，來減弱有害昆蟲對外界不利環(huán)境的防御能力，從而達(dá)到協(xié)助殺滅害蟲的目的。
　　 大豆蚜(Aphis glycines Matsumura)屬于半翅目(Hemiptera)、同翅類(Homoptera)、蚜科(Aphididae)、蚜屬(Aphis)，是危害栽培大豆(Glycine max)最為主要的害蟲之一，極大影響著大豆的品

3、質(zhì)和產(chǎn)量。目前，國內(nèi)外尚未專門針對Hsp70蛋白對大豆蚜進(jìn)行防治研究。本文通過RT-PCR及RACE技術(shù)克隆得到大豆蚜熱休克蛋白70基因（Hsp70與Hsc70），成功構(gòu)建表達(dá)載體，進(jìn)行原核表達(dá)，獲得大豆蚜Hsp70重組蛋白。并單頭提取各溫度熱激條件下的大豆蚜RNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR分析。為今后研究大豆蚜在受到熱脅迫后熱休克蛋白70的表達(dá)規(guī)律及熱控技術(shù)防治害蟲提供依據(jù)。
　　 本研究以大豆蚜{Aphis glycines

4、Matsumura)為材料，分別提取總RNA，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，分別擴增得到大豆蚜的Hsp70基因與Hsc70基因的全長cDNA序列。并利用大腸桿菌pET21b表達(dá)系統(tǒng)對二者進(jìn)行了原核表達(dá)，得到重組融合蛋白。
　　 本研究克隆了大豆蚜Hsc70 cDNA的全長的序列:這個序列含2281個堿基，其內(nèi)部包含一個1965個堿基的開放閱讀框，能夠編碼一個含654個氨基酸殘基的蛋白，分子量大小為71.41kDa，等電點pI:

5、5.22。大豆蚜Hsc70基因含兩個典型的Hsp70家族的簽名序列:1DLGTTYS（11～18殘基）殘基，IFDLGGGTFDVSIL（199～212殘基）。推導(dǎo)的氨基酸序列中存在6個N位糖基化位點。利用SignalP4.0 Server軟件分析后，結(jié)果表明:ORF核苷酸序列內(nèi)的18～19位為信號肽切割位點。在GenBank上大豆蚜登錄Hsc70的基因序列，獲得登錄號: KF052087。
　　 克隆了大豆蚜Hsp70 cDN

6、A全長序列:這個序列含2268個堿基，其中包括一個1962個堿基的開放閱讀框，能夠編碼一個含653個氨基酸殘基的蛋白，分子量大小為71.22 kDa，等電點pI:5.43。大豆蚜Hsp70基因含三個Hsp70家族的簽名序列:IDLGTTYS（10～17殘基），IFDLGGGTFDVSIL（198～211殘基），IVLVGGSTRIPK（335～349殘基）。推導(dǎo)的氨基酸序列中存在6個N位糖基化位點。利用SignalP4.0 Server

7、軟件分析后，結(jié)果表明:ORF核苷酸序列內(nèi)的17～18位為信號肽切割位點。在GenBank上大豆蚜登錄Hsp70的基因序列，獲得登錄號:JQ340173。
　　 研究結(jié)果表明:大豆蚜Hsp70與Hsc70基因均含20種相同種類氨基酸，且各類氨基酸含量基本相同，均富含甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、賴氨酸Lys。昆蟲熱休克蛋白Hsp70作為一種糖蛋白，糖基化是酶活化的重要因素之一。利用NetOGlyc2.0軟件發(fā)現(xiàn)在大豆蚜Hsp70氨基

8、酸序列和Hsc70氨基酸序列中均有6個糖基化位點，除N-位糖基化位點以外，昆蟲熱休克蛋白Hsp70的氨基酸序列內(nèi)含有很多硫酸化與磷酸化的位點，利用Expasy分子生物學(xué)服務(wù)器上的Prosite軟件能夠找到這些硫酸化與磷酸化位點，蛋白功能的發(fā)揮受到這些位點的調(diào)控。
　　 通過氨基酸序列一致性比較分析，可以明顯的看出，大豆蚜Hsp70/Hsc70與其他昆蟲Hsp70基因的氨基酸序列的相似度均在90％以上。
　　 分別重組大豆

9、蚜Hsp70/Hsc70基因至pET21b載體內(nèi)，在聚丙烯酰胺凝膠的電泳檢測后，都能夠檢測出目的融合蛋白。經(jīng)Western blot分析后，結(jié)果表明:重組質(zhì)粒pET/Hsp70的原核表達(dá)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，確為大豆蚜Hsp70基因的表達(dá)。
　　 利用Real time PGR技術(shù)，對不同溫度脅迫下大豆蚜Hsp70與Hsc70表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析表明:大豆蚜在25～37℃范圍內(nèi)，其Hsp70表達(dá)量隨溫度升高而上升，37℃時達(dá)到