大豆蚜（Aphis glycines Matsumura）COⅡ基因克隆及其天敵檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、大豆蚜(AphisglycinesMatsumura)是大豆苗期的主要害蟲之一，由于大豆蚜對(duì)化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)人們對(duì)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)大豆蚜進(jìn)行生物防治越來(lái)越受到人們的重視。豆田中蘊(yùn)含豐富的天敵昆蟲資源，如何把大量寶貴的自然天敵資源合理地利用起來(lái)，已經(jīng)成為大豆蚜生物防治的研究熱點(diǎn)之一。 對(duì)于捕食者-獵物間關(guān)系的研究以往多采用直接觀察法或免疫學(xué)分析法。直接觀察法容易產(chǎn)生誤差，而免疫學(xué)分析法費(fèi)用比較昂貴，隨著生物技術(shù)在昆蟲

2、學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，以DNA為基礎(chǔ)的分子技術(shù)特別是PCR技術(shù)已成功地應(yīng)用于捕食者-獵物間關(guān)系的研究中。線粒體DNA(mtDNA)是真核細(xì)胞中分子量較小而又較易純化的復(fù)制單位，因其遺傳結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，遵守嚴(yán)格的母系遺傳方式，且進(jìn)化速率較核DNA快，無(wú)重組現(xiàn)象等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子學(xué)研究中。本實(shí)驗(yàn)克隆、測(cè)定了大豆蚜細(xì)胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)基因序列，并對(duì)大豆蚜COⅡ基因序列進(jìn)行分析，同時(shí)利用大豆蚜COⅡ基因?yàn)槟繕?biāo)基因，以大豆蚜及其同領(lǐng)域發(fā)生

3、的捕食性天敵為研究對(duì)象，運(yùn)用PCR技術(shù)來(lái)定性檢測(cè)大豆蚜的捕食性天敵。 本試驗(yàn)主要研究結(jié)果如下： 1.克隆、測(cè)序得到大豆蚜細(xì)胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)基因序列，同時(shí)將該序列發(fā)送到GeneBank上，其登陸號(hào)是DQ265743。將所得的基因序列在NCBl網(wǎng)站上運(yùn)行BLAST程序，結(jié)果顯示所測(cè)基因序列與昆蟲mtDNA-COⅡ基因有很高的同源性。大豆蚜與禾谷縊管蚜、麥長(zhǎng)管蚜、麥二叉蚜、玉米蚜、美甘蔗偽毛蚜、棉蚜、桃蚜核苷酸同源性分

4、別為92.7％、92.8％、91.5％、93.0％、89.1％、95.6％、93.2％；氨基酸同源性分別為97.1％、96.1％、96.1％、97.1％、89.7％、97.8％、95.4％。 2.對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的大豆蚜COⅡ基因序列進(jìn)行組成性分析，結(jié)果顯示，大豆蚜COⅡ基因序列堿基組成存在明顯的偏向性，A、T、G、C含量分別為40.43％、39.01％、8.37％、12.20％，A+T含量為79.43％，G+C含量為20.57％，其

5、中密碼子第三位點(diǎn)的A+T含量達(dá)到94.04％，表現(xiàn)出非常強(qiáng)A+T含量偏向性。 3.大豆蚜COⅡ基因672bp序列共編碼223個(gè)氨基酸，密碼子以A、T結(jié)尾頻率高，沒(méi)有以G結(jié)尾的密碼子。在氨基酸組成上，亮氨酸(Leu)的含量最高，占總量的18.39％，丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)和纈氨酸(Val)的含量最低，都只有1.35％的含量，這說(shuō)明細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅱ的氨基酸組成存在一定的偏向性。 4.根據(jù)此基因序列與Gene

6、Bank上登錄的其它蚜蟲COⅡ基因序列進(jìn)行比對(duì)，利用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo設(shè)計(jì)出大豆蚜特異引物1對(duì)；特異性檢測(cè)結(jié)果表明，該引物只對(duì)大豆蚜具有擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)其它供試蚜蟲種類不具有擴(kuò)增能力。 5.用大豆蚜的特異引物對(duì)已取食大豆蚜的異色瓢蟲幼蟲、龜紋瓢蟲幼蟲、草蛉幼蟲、小花蝽成蟲和幼蟲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物均與以大豆蚜總DNA為模板，利用特異引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小一致的DNA片段，結(jié)果表明在上述天敵昆蟲的消化道殘留物中可以檢測(cè)到大