轉(zhuǎn)基因大豆MON87705及其產(chǎn)品的檢測技術(shù)研究.pdf

1、1983年，世界上第一例轉(zhuǎn)基因作物—轉(zhuǎn)基因煙草由美國研究人員成功培育。自此轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅猛，同時各國政府也制定了相關(guān)政策法規(guī)對轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品實施監(jiān)督管控。建立準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因生物檢測方法是實現(xiàn)監(jiān)管的前提。轉(zhuǎn)基因大豆MON87705是孟山都公司研發(fā)的品質(zhì)改良抗除草劑復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物。它是利用二元質(zhì)粒載體PV-GMPQ/HT4404通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化常規(guī)大豆A3525的分生組織得到的，含有FAD2-1A/FATB1Ab表達抑制盒和cp4

2、-epsps耐除草劑基因。
　　研究根據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆MON87705外源插入DNA和植物基因組結(jié)點區(qū)域序列查找相關(guān)文獻并設(shè)計轉(zhuǎn)化體特異性檢測引物，進行定性PCR擴增，通過引物篩選和優(yōu)化反應(yīng)條件獲得最佳反應(yīng)體系，從而建立轉(zhuǎn)基因大豆MON87705轉(zhuǎn)化事件特異性檢測方法。隨著對轉(zhuǎn)基因安全性研究的深入，僅僅定性已經(jīng)不能滿足檢測要求，因此進一步設(shè)計合適的探針與引物，研究該轉(zhuǎn)化事件的實時熒光定量PCR檢測方法，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線用于比對轉(zhuǎn)基因成分含

3、量。同時構(gòu)建轉(zhuǎn)基因大豆MON87705陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子替代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以解決標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲取困難的問題。主要研究結(jié)果如下：
　　1、將轉(zhuǎn)基因大豆MON87705相關(guān)文獻中報道的定性PCR引物與運用Primer Express3.0軟件自行設(shè)計4條轉(zhuǎn)化體特異性引物進行對比，發(fā)現(xiàn)MON87705GF/GR（318bp）擴增效率高于其他引物。其最適退火溫度為58℃。通過實驗驗證該定性 PCR檢測方法的特異性、靈敏度和重演性，在DNA含量為0.1

4、％及以上時都能擴增出318bp目的條帶，表明該轉(zhuǎn)基因大豆的定性檢測方法靈敏度較高，為0.1%。選取7家已通過“2+1認(rèn)證”的轉(zhuǎn)基因生物安全檢測機構(gòu)，對標(biāo)準(zhǔn)進行復(fù)核驗證，所有驗證單位均從含量為0.1%的MON87705大豆樣品中擴增獲得目的片段。說明該檢測方法適合作為轉(zhuǎn)基因大豆MON87705及其產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分檢測國家標(biāo)準(zhǔn)。
　　2、根據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆MON877053＇端側(cè)翼序列設(shè)計定量引物及探針并進行篩選優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)引物MON877

5、05qF/qR和探針MON87705qP熒光信號強，重復(fù)性好。對該引物探針組合進行特異性和靈敏度驗證，結(jié)果表明其特異性強，檢測極限為15個拷貝。
　　3、通過重組PCR的方法將MON877053＇端插入序列和大豆內(nèi)標(biāo)lectin序列組合到一起，然后將其連接到pMD18-T上，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因大豆MON87705標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-87705。通過測序分析該重組序列完整地插入到載體當(dāng)中。使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-87705進行定性、定量PC