轉(zhuǎn)基因大豆及其加工產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、該論文以轉(zhuǎn)基因大豆及其加工產(chǎn)品作為實(shí)驗(yàn)材料,相應(yīng)的包含了兩個(gè)相關(guān)而又不同水平的兩個(gè)部分.一部分是轉(zhuǎn)基因大豆(Roundup-Ready soybean)及其加工產(chǎn)品的DNA水平的檢測(cè)技術(shù)研究,另一部分是轉(zhuǎn)基因大豆的蛋白水平檢測(cè)技術(shù)研究.在DNA水平上的研究,首先優(yōu)化了轉(zhuǎn)基因大豆及其加工產(chǎn)品豆粕、豆腐、豆奶和醬油的DNA抽提方法,得到了OD值在1.7-1.9之間的高質(zhì)量的可用于PCR檢測(cè)的DNA .隨后,建立了基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(poly

2、merase chain reaction,PCR)和能夠在同一反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)片斷的復(fù)合PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的檢測(cè)方法,對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的外源基因EPSPS(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,來(lái)源于A.tumefaciens菌株CP4)和內(nèi)源基因Lectin(用于轉(zhuǎn)基因大豆的鑒別)進(jìn)行檢測(cè).根據(jù)EPSPS和Lectin特異的基因序列,利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了兩對(duì)引

3、物.使用這兩對(duì)引物進(jìn)行的PCR分析結(jié)果表明對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.01ng.復(fù)合PCR檢測(cè)結(jié)果表明,該文設(shè)計(jì)的這兩對(duì)引物可以成功的用于轉(zhuǎn)基因大豆及其加工產(chǎn)品豆粕、豆腐、豆奶和醬油的檢測(cè).最后,利用Primer Premier 5.0和Beacon Designer 2.0軟件設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物和探針,建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Taqman技術(shù)反應(yīng)體系,并繪出了用于大豆轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線.Taqman技術(shù)的PCR分析結(jié)果表

4、明定量PCR檢測(cè)的靈敏度可達(dá)0.01ng.應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，建立了17株能穩(wěn)定分泌抗EPSPS重組蛋白的單克隆抗體（McAb）的雜交瘤細(xì)胞株.所有的雜交瘤細(xì)胞株接種至預(yù)先進(jìn)行腹腔注射降植烷的Bal b/c小鼠腹腔均能穩(wěn)定的產(chǎn)生瘤性腹水，腹水用45％的硫酸銨溶液進(jìn)行初步純化.隨后將得到的單克隆抗體初步用于轉(zhuǎn)基因大豆的雙抗體夾心ELISA（DAS-ELISA）檢測(cè)當(dāng)中.利用抗體技術(shù)進(jìn)行的免疫分析是用于已知抗原檢測(cè)的理想方法，單克隆抗體（通常具