鹽地堿蓬SsCMO基因的克隆及其對(duì)大豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、大豆的生長(zhǎng)發(fā)育同外界環(huán)境緊密相關(guān)，環(huán)境中的許多非生物因素如干旱、鹽堿、冰凍、低溫等脅迫會(huì)影響大豆的生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致大豆的產(chǎn)量大幅度減產(chǎn)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強(qiáng)大豆的抗逆性，培育一批具有較強(qiáng)抗逆性的大豆新品系，對(duì)解決我國(guó)的產(chǎn)業(yè)危機(jī)具有十分重要的意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用采集于浙江灘涂的鹽地堿蓬種子，在浙江省農(nóng)科院作物與核技術(shù)利用研究所溫室大棚的塑料盆內(nèi)培育，連續(xù)澆以6％的NaCl溶液進(jìn)行脅迫處理，提取鹽地堿蓬總RNA，反轉(zhuǎn)錄成

2、cDNA，然后進(jìn)行基因克隆，獲得目的基因片段，并利用TAIL PCR技術(shù)獲得目的基因3'和5'端序列。將目的基因構(gòu)建到含Bar標(biāo)記基因的pBA002植物表達(dá)載體中，利用熱激發(fā)將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中。然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以胚尖和帶一片子葉的胚尖作為遺傳轉(zhuǎn)化體系的外植體，對(duì)大豆進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究。同時(shí)，還研究了外源甜菜堿和NaCl對(duì)大豆苗期的影響。實(shí)驗(yàn)取得了如下主要研究成果:
　　 1、從鹽地堿蓬中克隆了一個(gè)在甜菜堿合成過(guò)程中起

3、關(guān)鍵作用的膽堿單加氧酶(CMO)基因?；蛉L(zhǎng)2260 bp，包括564 bp的5’端、1332 bp的CDS和364 bp的3’端。該基因編碼443個(gè)氨基酸，由二十種氨基酸組成，其中含的Ser、Thr、Val較多，Met最少。通過(guò)對(duì)SsCMO蛋白與其它CMO蛋白的多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)SsCMO蛋白氨基酸序列在162-167區(qū)域和290-296區(qū)域存在兩個(gè)十分保守的序列。同時(shí)通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，顯示了遼寧堿蓬S1CMO與鹽地堿蓬SsCMO具

4、有最高同源性。
　　 2、在克隆載體質(zhì)粒pTA2-SsCMO的基礎(chǔ)上，利用雙酶切，將SsCMO基因從克隆載體中分離出來(lái)，與植物表達(dá)載體pBA002進(jìn)行了連接，構(gòu)建了既含Bar標(biāo)記基因又含SsCMO目的基因的雙元植物表達(dá)載體，利用熱激法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)大豆品種‘浙春3號(hào)’和‘南農(nóng)88-31’進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化研究，對(duì)轉(zhuǎn)基因苗涂抹10 mg/L Basta進(jìn)行初篩，然后提取大豆葉片總DNA，對(duì)目的基因進(jìn)行PC

5、R擴(kuò)增，并對(duì)T-DNA區(qū)域構(gòu)建特異性的PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示T0分別獲得28個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，平均轉(zhuǎn)化率為1.2％。
　　 3、以大豆品種‘浙春3號(hào)’為研究材料，在苗期施加外源甜菜堿和NaCl，通過(guò)生理生化指標(biāo)的分析，發(fā)現(xiàn)施加400 mg·L-1的外源甜菜堿可以顯著增加葉片光合色素和可溶性糖的含量，減少脯氨酸、丙二醛的積累，降低葉片的相對(duì)電導(dǎo)率，增強(qiáng)了豆苗的根系活力;說(shuō)明施加合適濃度的外源甜菜堿可以提高植株葉片的光合活性，增強(qiáng)大豆幼苗