甜菜夜蛾和斜紋夜蛾性信息素感受相關(guān)蛋白的分子克隆、定量分析及原核表達(dá).pdf

1、昆蟲在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了高度靈敏的嗅覺系統(tǒng)，并以此來(lái)感受自然環(huán)境中的各種化學(xué)信息，產(chǎn)生相應(yīng)的生理和行為反應(yīng)，如尋找配偶、食物源和棲息場(chǎng)所、產(chǎn)卵行為、逃避危險(xiǎn)或者不適合的棲息地和寄主等，因此嗅覺系統(tǒng)對(duì)于昆蟲的生命活動(dòng)至關(guān)重要。將昆蟲嗅覺應(yīng)用于害蟲防治，已成為害蟲管理的一個(gè)重要手段，并將在未來(lái)害蟲治理中起到越來(lái)越重要的作用。甜菜夜蛾和斜紋夜蛾是世界性分布的重要農(nóng)業(yè)害蟲，危害很多種糧食和蔬菜作物，生產(chǎn)上主要依靠化學(xué)防治，但由于害蟲抗藥性以及

2、蔬菜等作物的無(wú)公害防治要求，迫切需要尋求新的防治技術(shù)。這兩種夜蛾雌蟲性信息素組分已得到鑒定，并成功用于田間種群的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，但將性信息素直接用于害蟲的大量誘殺或交配干擾，防治效果并不理想。因此，深入研究蛾類昆蟲性信息素通訊的分子機(jī)制，弄清性信息素感受相關(guān)蛋白及其功能，必將有助于針對(duì)特定嗅覺蛋白設(shè)計(jì)和開發(fā)更為高效的兩性通訊的調(diào)控技術(shù)，服務(wù)于蔬菜和糧食的無(wú)公害生產(chǎn)。本文對(duì)甜菜夜蛾和斜紋夜蛾性信息素感受相關(guān)蛋白進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下：

3、 1.甜菜夜蛾信息素結(jié)合蛋白基因的克隆和序列分析 通過(guò)比較幾種已發(fā)表夜蛾科昆蟲的信息素結(jié)合蛋白(PBPs)氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)簡(jiǎn)并性引物，利用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)從甜菜夜蛾雄蟲觸角擴(kuò)增得到2個(gè)分別為275bp和281bp的cDNA片段SexigPBP1和SexigPBP2。隨后，利用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)進(jìn)行兩個(gè)cDNA全序列克隆，SexigPBP1cDNA全序列為1，077bp，Sexig

4、PBP2為819bp。S. exigua的2個(gè)PBP基因推導(dǎo)的氨基酸序列與己知其它鱗翅目昆蟲PBP具有較高的同源性，但彼此間的同源性為44％。 以基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增后，發(fā)現(xiàn)S. exigua的2個(gè)PBP基因具有相同的intron/extron結(jié)構(gòu)，各含有2個(gè)內(nèi)含子，并且內(nèi)含子具有典型的GT-AG結(jié)構(gòu)。SexigPBPJ在Glu45和Leu46之間插入一個(gè)87 bp的內(nèi)含子；在Asp105內(nèi)插入第二個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)142bp。

5、SexigPBP2在Glu49和Met50之間插入一個(gè)295 bp的內(nèi)含子；在Asp110內(nèi)插入第二個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)644bp。 RT-PCR結(jié)果表明SexigPBP1和SexigPBP2在雌雄蟲觸角內(nèi)均有表達(dá)，但在其他組織中不表達(dá)。進(jìn)一步用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)比較了雌雄蛾觸角內(nèi)兩個(gè)PBP基因的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌蛾觸角內(nèi)的SexigPBP1和SexigPBP2的表達(dá)水平僅為雄蛾的39％和73％。 2.斜紋夜蛾信息素結(jié)合蛋白

6、基因的克隆和序列分析 利用RT-PCR和RACE技術(shù)，從斜紋夜蛾雄蛾觸角擴(kuò)增得到2個(gè)信息素結(jié)合蛋白(PBPs)cDNA全序列：SlitPBP1和SlitPBP2。SlitPBP1全序列為1，085 bp，編碼164個(gè)氨基酸，N-端頭23個(gè)氨基酸為預(yù)測(cè)的信號(hào)肽，其后的成熟蛋白由141個(gè)氨基酸組成，預(yù)測(cè)分子量為16,285 Da，等電點(diǎn)為5.14。SlitPBP2全長(zhǎng)804 bp，編碼170個(gè)氨基酸，最初27個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，143

7、個(gè)氨基酸組成的成熟蛋白預(yù)測(cè)分子量為15,998 Da，等電點(diǎn)為4.92。2個(gè)PBP基因推導(dǎo)的氨基酸序列與已知其它鱗翅目昆蟲PBP具有較高的同源性，兩者彼此之間的同源性為45％。 SlitPBP1和SlitPBP2內(nèi)各含有2個(gè)內(nèi)含子，并且內(nèi)含子具有典型的GT-AG結(jié)構(gòu)。SlitPBP1在Glu45和Leu46之間插入一個(gè)76 bp的內(nèi)含子；在Asp105內(nèi)插入第二個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)104 bp。SlitPBP2在Glu49租Met50之

8、間插入一個(gè)437 bp的內(nèi)含子；在Asp110內(nèi)插入第二個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)1，251 bp?？梢?，PBP2的內(nèi)含子比PBP1長(zhǎng)得多，同一個(gè)基因第二個(gè)內(nèi)含子明顯比第一個(gè)長(zhǎng)。 RT-PCR結(jié)果表明SlitPBP1和Slit PBP2僅在雌雄蟲觸角內(nèi)表達(dá)。進(jìn)一步用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)比較了雌雄蟲觸角內(nèi)SlitPBP1和Slit PBP2的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌蛾觸角內(nèi)的SlitPBP1和SlitPBP2的表達(dá)水平僅為雄蛾的2.1％和7.0％。

9、 搜集現(xiàn)已報(bào)道的鱗翅目昆蟲PBP，利用Mega3.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示夜蛾科昆蟲的PBP被清楚地分為三個(gè)組，本研究發(fā)現(xiàn)的SexigPBP1和SlitPBP1同屬于第二組(Group2)，SexigPBP2和SlitPBP2同屬于第三組(Group3)。 3 甜菜夜蛾信息素結(jié)合蛋白基因的原核表達(dá)及蛋白純化 在成功克隆甜菜夜蛾2個(gè)PBP基因的基礎(chǔ)上，將SexigPBP1和SexigPBP2構(gòu)建到原核表達(dá)載

10、體pET-30a(+)中，在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，所表達(dá)的兩個(gè)重組蛋白約22kD，主要以包涵體形式存在。超聲波破碎離心后，用8M尿素對(duì)包涵體進(jìn)行溶解，經(jīng)鎳離子親和層析柱一步法純化得到的PBP的純度非常高，并且回收率也很高。為了避免N-端多余序列的干擾作用，利用腸激酶對(duì)已純化的目的蛋白進(jìn)行專一性酶解，酶解產(chǎn)物再經(jīng)親和層析純化，得到已除去N-端標(biāo)簽的目的蛋白(約16kD)，為進(jìn)一步研究PBP與

11、性信息素組分之間的作用打下基礎(chǔ)。利用常規(guī)免疫方法，用重折疊的目的蛋白SexigPBP1免疫Babl/c小鼠獲得較高效價(jià)抗體，為進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)提供材料。 4 甜菜夜蛾和斜紋夜蛾嗅覺受體基因的克隆和序列分析 高度變異的昆蟲嗅覺受體家族中有一類在不同目昆蟲中非常保守的嗅覺受體，本文通過(guò)比對(duì)幾種已發(fā)表昆蟲的嗅覺受體(ORs)氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)簡(jiǎn)并性引物，分別在甜菜夜蛾和斜紋夜蛾觸角內(nèi)克隆到292 bp和1，063bp的cD

12、NA片段，命名為SexiOR2和SlitOR2。利用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)進(jìn)行兩個(gè)cDNA全序列克隆，SexiOR2全長(zhǎng)為1，906 bp，閱讀框架全長(zhǎng)1，419 bp，編碼473個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為53,303 Da，等電點(diǎn)為8.60。SlitOR2全長(zhǎng)為2,483 bp，閱讀框架全長(zhǎng)1，419 bp，編碼473個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為53,267 Da，等電點(diǎn)為8.63。SlitOR2的3’非編碼區(qū)(937 bp)要比

13、SexiOR2的(350 bp)長(zhǎng)很多。經(jīng)預(yù)測(cè)氨基酸序列中具有典型的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的七個(gè)跨膜區(qū)域。SexiOR2和SlitOR2與已知其它昆蟲嗅覺受體的同源性都在50％以上，并且兩者之間的同源性高達(dá)98％。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，已知的鱗翅目昆蟲嗅覺受體蛋白獨(dú)立形成一組。 本論文利用分子生物學(xué)技術(shù)，成功克隆出與甜菜夜蛾和斜紋夜蛾性信息素感受有關(guān)的兩類蛋白，并進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化等相關(guān)分析。在此基礎(chǔ)上，用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化了甜