甜菜夜蛾嗅覺受體和感覺神經元膜蛋白基因的克隆、表達定位及功能研究.pdf

1、昆蟲個體之間以及個體與環(huán)境之間的關系主要依靠化學通訊來調節(jié)，嗅覺是昆蟲主要的行為反應模式，通過位于嗅覺組織表面的各類嗅覺感受器，昆蟲能夠感受到環(huán)境中大量的氣味信息，產生相應的生理或行為反應，如尋找寄主植物、交配產卵、躲避危險等。昆蟲特別是蛾類昆蟲兩性間的化學通訊具有高度的靈敏性和種特異性，根據這一特性設計的性引誘劑已經廣泛應用于害蟲的種群監(jiān)測和害蟲防治的實踐中。目前發(fā)展的害蟲引誘劑有諸多缺點，如結構不穩(wěn)定、通常只能引誘雄蟲等，這對于多次

2、交配的鱗翅目害蟲防治效果并不理想，主要原因是對害蟲嗅覺識別的分子機理的研究不夠深入。研究表明在昆蟲外周感受器中有多種蛋白參與了嗅覺識別的過程，如氣味結合蛋白（Odorantbindingproteins,OBPs）、氣味降解酶(Odorantdegradingenzyme，ODEs)、氣味受體（Odorantreceptors，ORs;Ionotropicreceptors,IRs）、感覺神經元膜蛋白（Sensoryneuronmemb

3、raneproteins，SNMPs）等，在鱗翅目中對于氣味結合蛋白的研究較多，而對于OR及SNMP的研究較少。OR位于感覺神經樹突膜上，外界的氣味信號在這里轉化為電信號，而SNMP可能在外界氣味分子順利到達進而激活氣味受體的過程中起重要作用。本研究針對我國重要農業(yè)害蟲甜菜夜蛾Spodopteraexigua尋找寄主植物及雌雄個體間的交流的分子機理進行研究，克隆了甜菜夜蛾雄蟲識別雌蟲性信息素的性信息素受體基因(OR6，OR11，OR13

4、，OR16)，通過體外表達和電生理記錄研究了這些受體的功能;克隆和鑒定了2個在甜菜夜蛾尋找寄主過程中起重要作用的氣味受體基因(OR3，OR18);克隆了2個SNMP基因并對其進行了感器定位研究，探討了SNMP在性信息素識別過程中的可能作用。主要結果如下:
　　1、甜菜夜蛾性信息素受體基因的鑒定、表達分析和功能研究
　　通過同源克隆的方法在甜菜夜蛾觸角中獲得4個性信息素受體(PR)基因片段，進一步通過RACE技術獲得全長，并登

5、錄到GenBank，基因名稱（GenBank登錄號）分別為SexiOR6(KC299916)、SexiOR11(KC299917)、SexiOR13(KC299918)和SexiOR16(KC299919)。進化樹分析表明，這4個PR與已經報道的鱗翅目昆蟲性信息素受體聚類到一個亞族。利用實時熒光定量PCR(qPCR)進行表達水平的測定，發(fā)現(xiàn)這4個PR都在觸角中高表達，其中SexiOR6、SexiOR13和SexiOR16主要在雄蟲觸角中

6、高表達，這與雄蟲利用這些受體感受雌蟲性信息素的功能相一致;SexiOR1在雌雄蟲觸角中均高表達;另外，4個基因在其它的嗅覺組織（如下唇須和喙）中也有微量表達。PR的這種表達模式與昆蟲行為反應的關系有待進一步研究。進一步比較這4個PR在觸角中的表達量發(fā)現(xiàn)，在雄蟲觸角中SexiOR6的表達量最高，約為其它3個PR的10倍左右，這與其它近緣種的幾種性信息素受體的表達量差異不一致，可能緣于昆蟲種間的差異。
　　在非洲爪蟾卵母細胞（Xeno

7、pusoocytes）分別對4個PR和Orco基因進行共表達，并用雙電極電壓鉗記錄系統(tǒng)測定PR/Orco對性信息素組分的反應，結果顯示，SexiOR13和SexiOR16對甜菜夜蛾的性信息素都有反應。比較而言，SexiOR13對Z9，E12-14∶OAc和Z9-14∶OAc的反應最大，但對Z9，E12-14∶OAc的靈敏度(EC50=3.158×10-6M)是Z9-14∶OAc(EC50=1.203×10-5M)的4倍左右。而SexiO

8、R16對Z9-14∶OH的反應最大，靈敏度很高(EC50=9.690×10-7M)。研究結果為進一步明確性信息素感受的分子機制奠定了基礎。
　　2、甜菜夜蛾普通氣味受體基因的鑒定、定位和功能研究
　　利用同源克隆的方法從甜菜夜蛾觸角中獲得2個普通氣味受體基因片段，并通過RACE技術獲得全長cDNA。2個基因名稱（GenBank登錄號）分別為SexiOR3(JF747606)和SexiOR18(JN873314)。進化分析發(fā)現(xiàn)

9、，這2個OR屬于龐大的普通氣味受體亞家族。qPCR測定發(fā)現(xiàn)，2個普通氣味受體主要在觸角中表達，但不同于性信息素受體的是，它們在雌蟲觸角中的表達量顯著高于雄蟲觸角。利用原位雜交技術（insituhybridization）定位了這2個基因以及Orco基因在成蟲觸角中的表達，發(fā)現(xiàn)SexiOR3主要在短毛形感器下表達，長毛形感器下少量表達而在腔錐形感器和刺形感器下沒有表達;SexiOR18主要在毛形感器（包括長毛形感器和短毛形感器）和錐形感器

10、下表達，而在腔錐形感器和刺形感器下不表達;SexiOrco基因的表達比較廣泛，在毛形感器、錐形感器、腔錐形感器下都有表達，但在栓錐形感器和刺形感器中沒有表達。
　　利用非洲爪蟾卵母細胞進行異源表達SexiOR3和SexiOR18，然后用雙電極電壓鉗記錄系統(tǒng)測定了3個OR對62種植物氣味的反應。結果表明，SexiOR3僅對E-β-法尼烯、法尼醇、橙花叔醇、香葉醇和己酸壬酯有明顯的反應，其中對E-β-法尼烯的反應最強，EC50=3.5

11、99×10-7M。進一步篩選發(fā)現(xiàn)苯乙醛能顯著抑制SexiOR3對E-β-法尼烯的反應，且在高濃度時抑制作用更強，而對其它幾種能引起SexiOR3反應的化合物沒有抑制作用，推測苯乙醛是SexiOR3識別E-β-法尼烯的抑制劑。SexiOR18對所測定的普通氣味均無反應，其功能有待于進一步研究。
　　3、甜菜夜蛾感覺神經元膜蛋白基因的克隆、序列分析和表達水平研究
　　利用同源克隆的方法從甜菜夜蛾觸角中獲得2個感覺神經元膜蛋白基因

12、的開放閱讀框全長，基因名稱（GenBank登錄號）分別為SexiSNMP1JX469106）和SexiSNMP2(JX469107)。將2個SNMP進行進化樹分析發(fā)現(xiàn)，兩者分別屬于SNMP1和SNMP2亞組，兩者間的氨基酸相似度僅29％。qPCR測定發(fā)現(xiàn)，SexiSNMP1在成蟲觸角中特異性表達;SexiSNMP2除在成蟲觸角中高表達外，在喙和下唇須等組織中也有少量表達。2個SexiSNMP相比較，在雄蟲觸角中SexiSNMP2的表達量

13、顯著高于SexiSNMP1，而在雌蟲觸角中兩者沒有差異。利用原位雜交技術定位了這2個基因在雌雄觸角中的感器分布，結果顯示，SexiSNMP1和SexiSNMP2在毛形感器和錐形感器下都有表達，暗示這2個基因不僅參與感受性信息素而且還參與普通氣味的識別。
　　綜上所述，本文首次從甜菜夜蛾的觸角中克隆了6個氣味受體基因和2個感覺神經元膜蛋白基因，測定了這些基因的表達特征，并初步研究了這些基因在性信息素組分及62種普通氣味感受中的功能。