棉鈴蟲感覺神經(jīng)元膜蛋白和G蛋白α亞基基因克隆表達(dá)及其相互作用蛋白的篩選.pdf

1、本文利用RACE技術(shù)結(jié)合PCR克隆了Gq蛋白α亞基基因；采用半定量RT-PCR研究了Gqα和SNMP的兩個(gè)基因在棉鈴蟲體內(nèi)的時(shí)空表達(dá)情況；對兩個(gè)基因進(jìn)行原核表達(dá)和純化；利用酵母雙雜交技術(shù)研究已經(jīng)克隆的Gqα和SNMP是否互作，并篩選與Gqα相互作用的蛋白。本研究所取得的結(jié)果如下： (1)利用PCR結(jié)合RACE技術(shù)從棉鈴蟲觸角中首次克隆了G蛋白α亞基基因，經(jīng)過BLAST搜索同源序列發(fā)現(xiàn)其屬于G蛋白α亞基的q家族。已被GenBank

2、數(shù)據(jù)庫收錄，登錄號AY957405，命名為GqαHarm。GqαHarm與已報(bào)道的昆蟲和其他無脊椎動(dòng)物的Gq蛋白α亞基相似性在90％以上。與近緣種甘藍(lán)夜蛾MamestrabrassicaeGqα的相似性高達(dá)96.88％；與家蠶BomyxmoriGqα的相似性高達(dá)97.73％；與果蠅(Drosophilamelanogaster)Gqα的相似性高達(dá)89.52％；與線蟲CaenorhabditiselegansGqα的相似性高達(dá)81.69％

3、；與加勒比龍蝦PanulirusargusGqα的相似性高達(dá)87.25％。 (2)半定量RT-PCR研究表明，GqαHarm在棉鈴蟲雌雄成蟲觸角中表達(dá)，在頭、胸、腹、足和翅中也有表達(dá)，并且表達(dá)量差異不顯著；此外，在喙、下顎須和下唇須中也有表達(dá)；在卵、幼蟲、蛹和成蟲體內(nèi)也都有表達(dá)；在卵中的表達(dá)量最高，而在成蟲中的表達(dá)量最低，在幼蟲和蛹的前、中、后期的表達(dá)量差異不大。研究表明GqαHarm是一種普遍存在的蛋白。棉鈴蟲GqαHarm的

4、這種組織分布廣泛性，可能預(yù)示其參與細(xì)胞的多種信號傳導(dǎo)途徑。 (3)棉鈴蟲感覺神經(jīng)元膜蛋白基因序列法國人已經(jīng)報(bào)道(Jacquin-Joly，E.andFrancois，M.-C.，2003GenBanK，AF462067)。利用特異性引物從本實(shí)驗(yàn)室棉鈴蟲觸角中克隆了一條全長1690bp的cDNA序列，感覺神經(jīng)元膜蛋白(SNMP)閱讀框全長1572bp，編碼523個(gè)氨基酸殘基，序列中有2個(gè)跨膜區(qū)，具有昆蟲感覺神經(jīng)元膜蛋白的典型特征。

5、SNMP與已報(bào)道的其它昆蟲的感覺神經(jīng)元蛋白的氨基酸序列有很高的相似性。半定量RT-PCR研究結(jié)果顯示，SNMP在棉鈴蟲中不僅在觸角中表達(dá)，也在去掉觸角的頭、足中表達(dá)。但是在觸角中的表達(dá)量最高，在雌雄觸角中的表達(dá)量差異不顯著。在棉鈴蟲的味覺器官如：喙，下顎須和下唇須中也有表達(dá)。在卵、蛹和成蟲體內(nèi)也都有表達(dá)，在卵中表達(dá)量相對較低。SNMP在棉鈴蟲體內(nèi)的時(shí)空表達(dá)情況表明：SNMP不僅參與棉鈴蟲的嗅覺識別，而且還參與棉鈴蟲的味覺識別。

6、(4)將棉鈴蟲GqαHarm和SNMP基因分別亞克隆到原核表達(dá)載體pET-21b的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET/GqαHarm和pET/SNMP。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，目的基因在大腸桿菌中成功進(jìn)行表達(dá)，但是蛋白以包涵體形式存在。對包涵體進(jìn)行溶解和重折疊后，經(jīng)過親和層析對重組蛋白進(jìn)行了初步純化。得到了比較純的Gqα，但是使用同樣的純化方法沒有得到純的SNMP。 (5)通過構(gòu)建棉鈴蟲觸角的cDNA文庫，用克隆的α亞基做誘餌進(jìn)行酵母

7、雙雜交篩選，得到與其相互作用的蛋白。共鑒定了43個(gè)陽性克隆，并且對這些克隆測序。通過GenBank查詢和分析，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)克隆與性外激素結(jié)合蛋白(PBP)高度同源，這為GqαHarm參與氣味信號傳導(dǎo)提供了證據(jù)。另外，還發(fā)現(xiàn)了與G蛋白α亞基互作的蛋白，如，3-磷酸甘油醛脫氫酶、核糖體蛋白S20、細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ、細(xì)胞色素氧化酶C亞基Ⅱ、促咽側(cè)體素神經(jīng)肽前體(AT2)、翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)、體液凝集素前肽。這些克隆的獲得，為進(jìn)一步研

8、究棉鈴蟲G蛋白α亞基在信號傳導(dǎo)中的作用奠定了基礎(chǔ)。 (6)用酵母雙雜交系統(tǒng)研究克隆的棉鈴蟲G蛋白α亞基和SNMP之間是否存在互作。本試驗(yàn)沒有篩到相互作用的陽性克隆，可能是這兩個(gè)蛋白之間不能結(jié)合或結(jié)合力很弱，推測棉鈴蟲中SNMP可能與G蛋白其他家族的α亞基互作，有待進(jìn)一步試驗(yàn)證明。 綜上所述，本研究首次從棉鈴蟲觸角中克隆了G蛋白α亞基，在GenBank中的登錄號為AY957405。對G蛋白α亞基與SNMP進(jìn)行了不同組織和階

9、段發(fā)育轉(zhuǎn)錄水平的研究，證實(shí)克隆的G蛋白α亞基屬于普遍存在的蛋白，可能參與細(xì)胞多種信號途徑的傳導(dǎo)；SNMP的時(shí)空表達(dá)情況說明其在棉鈴蟲體內(nèi)不是觸角特異性蛋白，既參與氣味識別，又參與味覺識別。酵母雙雜交的研究表明，G蛋白α亞基能與性外激素結(jié)合蛋白作用，參與棉鈴蟲的氣味信號傳導(dǎo)。棉鈴蟲G蛋白α亞基和SNMP不能互作。以上對棉鈴蟲G蛋白的研究結(jié)果，目前在國內(nèi)外均未見報(bào)道。這些成果的取得，不僅圓滿完成了國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目規(guī)定的研究任務(wù)，同時(shí)為進(jìn)