棉鈴蟲HaABCC2基因克隆及mRNA表達(dá).pdf

1、棉鈴蟲是一種多食性農(nóng)業(yè)害蟲，在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生。轉(zhuǎn)Bt基因作物自1996年開始在全球范圍內(nèi)推廣種植，有效控制了靶標(biāo)害蟲的為害，同時(shí)也顯著減少了化學(xué)殺蟲劑的使用。我國(guó)自1997年開始推廣種植表達(dá)Cry1Ac毒素蛋白的Bt棉花，到2012年種植面積已達(dá)400萬(wàn)公頃。Bt棉花的廣泛種植大大降低了棉花及其他寄主作物上棉鈴蟲的種群密度。鑒于國(guó)外已有田間害蟲對(duì)Bt作物產(chǎn)生抗性的報(bào)道及我國(guó)北方棉區(qū)部分棉鈴蟲種群對(duì)Cry1Ac敏感性下降的事實(shí)，棉鈴蟲

2、對(duì)Bt棉花的抗性演化將是Bt棉花持續(xù)應(yīng)用的最大威脅。
　　腺苷三磷酸結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP結(jié)合盒式蛋白，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）是一類膜整合蛋白，其利用水解ATP的能量對(duì)溶質(zhì)中各種生物分子進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)維持細(xì)胞正常的生理功能起重要作用。已有研究表明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員中的ABCC2基因變異能夠引起昆蟲對(duì)Bt產(chǎn)生抗性。本文克隆了棉鈴蟲HaABCC2基因的全長(zhǎng)cDNA序列，研究了該基因在棉鈴蟲體內(nèi)的時(shí)空表達(dá)，并檢測(cè)了HaABCC2基因

3、在棉鈴蟲不同品系間的表達(dá)。本文結(jié)果表明HaABCC2與所檢測(cè)的4個(gè)棉鈴蟲品系的Cry1Ac抗性無(wú)關(guān)。
　　1.克隆棉鈴蟲HaABCC2基因
　　轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCC2負(fù)責(zé)在昆蟲的腸腔及消化道中富集運(yùn)送重金屬離子、次生代謝物到體外，是昆蟲體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的潛在的毒素受體。本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆了棉鈴蟲ABCC2transporter的全長(zhǎng)cDNA序列。HaABCC2基因的全長(zhǎng)cDNA序列大小為4113bp，開放閱讀框

4、為4017bp，編碼1339個(gè)氨基酸，并進(jìn)行同源性分析得出與棉鈴蟲HaABCC2基因序列與煙芽夜蛾的相似度最高(93％)，與其他昆蟲類物種的相似度的取值范圍是63％～68％。ABCC2transporter的開放閱讀框存在單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。
　　2.棉鈴蟲HaABCC2基因的時(shí)空表達(dá)
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，將本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的敏感品系在時(shí)間上（卵、1～2齡幼蟲、3～4齡幼蟲、5齡幼蟲、雄性蛹、雌性蛹、雄性成蟲、雌性成

5、蟲）、空間上（5齡幼蟲的整頭蟲體、5齡幼蟲的前腸、5齡幼蟲的中腸、5齡幼蟲的后腸、5齡幼蟲的脂肪體、五齡幼蟲的馬氏管、5齡幼蟲的外皮）分別做相對(duì)定量PCR，比較HaABCC2基因在時(shí)間上、空間上的表達(dá)情況。結(jié)果表明:1、時(shí)間上，從卵到5齡幼蟲，目標(biāo)基因表達(dá)量逐漸提高并且各組間有明顯差異，到雄性蛹等其余四組的目標(biāo)基因表達(dá)量降低到最低且無(wú)明顯差異。以雌性成蟲HaABCC2基因的相對(duì)表達(dá)量為1，則HaABCC2基因在各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)

6、量分別為卵期(5.50)、1-2齡幼蟲(9.16)、3-4齡(13.85)、5齡(26.72)、雌性蛹(2.83)、雄性蛹(1.78)、雄性成蟲(1.38);2、空間上，前腸中的HaABCC2基因的相對(duì)表達(dá)量水平最高，后腸的、中腸的、馬氏管的、脂肪體的HaABCC2基因的相對(duì)表達(dá)量水平依次降低，外皮的HaABCC2基因的相對(duì)表達(dá)量最低。以相對(duì)表達(dá)量最低的外皮的HaABCC2基因的相對(duì)表達(dá)量為1，則各組織部位的HaABCC2基因的相對(duì)表達(dá)

7、量分別為前腸(977.04)、后腸(883.32)、中腸(528.44)、馬氏管(59.44)、脂肪體(2.83);此外在整頭蟲體內(nèi)的HaABCC2基因的相對(duì)表達(dá)量為164.72。
　　3.棉鈴蟲HaABCC2基因在敏感品系與抗性品系間表達(dá)量的比較
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，比較了棉鈴蟲HaABCC2基因在本實(shí)驗(yàn)內(nèi)抗性品系棉鈴蟲（4個(gè)品系）與敏感品系（1個(gè)品系）的表達(dá)情況。結(jié)果表明，HaABCC2基因在棉鈴蟲敏感品系及

8、四個(gè)抗性品系的蟲體內(nèi)中均有表達(dá)，并互相之間存在一定的差異。HaABCC2基因在CAD品系中表達(dá)量較高，與敏感品系SCD的表達(dá)量沒(méi)有明顯差異。目的基因在其余三個(gè)抗性品系中的表達(dá)量與SCD的相比，均有一定程度的下調(diào)，其中:HaABCC2基因在CYTO品系中表達(dá)量約為SCD的0.67倍，HaABCC2基因在AY423品系中表達(dá)量約為SCD的0.68倍，HaABCC2基因在廊坊品系中表達(dá)量約為SCD的0.67倍;并且HaABCC2基因在CYTO