褐飛虱和棉鈴蟲魚尼丁受體基因的克隆與mRNA表達分析.pdf

1、褐飛虱Nilaparvata lugens(St(a)l)屬同翅目、飛虱科（Homoptera: Delphacidae)，是我國和許多亞洲國家重要的水稻害蟲，通過直接取食和傳播水稻草狀矮化病毒(Rice grassystunt virus，RGSV)和水稻齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV）而危害水稻。棉鈴蟲Helicoverpa armigrea(Hübner)屬鱗翅目、夜蛾科(Lepidopte

2、ra: Noctuidae)，是亞洲、大洋洲、非洲及歐洲危害棉花及其他作物的主要害蟲之一。目前對褐飛虱和棉鈴蟲的主要防治方法還是依靠化學手段，由于藥劑使用不當?shù)仍蚴沟眠@兩種害蟲對多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗性，因此，研發(fā)具有新型作用機制的殺蟲劑至關(guān)重要。魚尼丁受體(ryanodine receptors，RyRs)是一種控制Ca2+從細胞內(nèi)部釋放到細胞質(zhì)中的配基門控鈣離子通道，最近發(fā)現(xiàn)的鄰苯二甲酰胺類和鄰甲酰胺基苯甲酰胺類新型殺蟲劑使得魚尼丁受

3、體的研究再次受到關(guān)注。本文克隆了褐飛虱和棉鈴蟲的魚尼丁受體基因，分析了魚尼丁受體基因在褐飛虱和棉鈴蟲不同發(fā)育階段的表達模式，研究結(jié)果對進一步提高對昆蟲魚尼丁受體結(jié)構(gòu)和功能的認識以及新型高效殺蟲劑的創(chuàng)制具有重要的理論意義和實踐價值。
　　通過反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應技術(shù)(RT-PCR)和cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE)克隆了褐飛虱和棉鈴蟲RyR全長cDNA，命名為NIRyR和HaRyR。NIRyR的開放閱讀框長15423bp，編碼5

4、140個氨基酸殘基。HaRyR開放閱讀框長15429bp，編碼5142個氨基酸殘基。NlRyR和稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis、小菜蛾P(guān)lutella xylostella、果蠅Drosophila melanogaster的RyR的氨基酸序列一致性分別為81％、79％和78％。HaRyR和稻縱卷葉螟、小菜蛾、果蠅RyR的氨基酸序列一致性分別為94％、92％和78％。作為Ca2+釋放通道的孔道形成區(qū)域(por

5、e-forming segments)一部分的GXRXGGGXGD基序在NlRyR(4989-4998)和HaRyR(4994-5003)中高度保守，表明NIRyR和HaRyR可形成功能性Ca2+通道。分別位于NlRyR和HaRyR蛋白C末端4199-4226和4234-4261處與4218-4245和4253-4280處的兩個EF-hands表明NIRyR和HaRyR和哺乳動物RyRs相似，可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+釋放。保守性結(jié)構(gòu)域分析

6、發(fā)現(xiàn)，NlRyR和HaRyR都含有20個結(jié)構(gòu)域，其中包括6個跨膜結(jié)構(gòu)域。
　　通過熒光定量PCR研究了NIRyR和HaRyR在不同發(fā)育階段的mRNA表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NIRyR和HaRyR在不同發(fā)育階段的mRNA表達水平存在較大差異。NIRyR的mRNA表達水平在卵和幼蟲期沒有顯著差異，但從1齡到4齡逐漸下降，4齡到5齡明顯上升。長翅雌蟲NlRyR的mRNA表達水平顯著高于短翅雌蟲和長翅及短翅雄蟲。HaRyR在棉鈴蟲卵中的表達量

7、最低，在3齡幼蟲、雌蛹、雄蛹、雌成蟲的表達量沒有顯著差異，但雄成蟲的表達量顯著高于其它發(fā)育階段，同時HaRyR在棉鈴蟲頭部的表達量也顯著高于胸部和腹部。此外，在NIRyR中發(fā)現(xiàn)了3個選擇性剪接位點，包括2個選擇性外顯子和一對互斥外顯子，在HaRyR中發(fā)現(xiàn)了一個選擇性剪接位點。對NIRyR互斥外顯子的特異性PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在褐飛虱的卵、1齡和3齡若蟲及長翅雄蟲和短翅雌蟲所有cDNA克隆中都檢測到外顯子A，外顯子B在5齡幼蟲、長翅雌蟲和短翅