棉鈴蟲和赤擬谷盜鈉離子通道基因的克隆與選擇性剪接分析.pdf

1、電壓門控鈉離子通道在細(xì)胞興奮性傳導(dǎo)過程中具有重要作用，也是DDT、擬除蟲菊酯和新型噁二嗪類殺蟲劑的主要作用靶標(biāo)。目前，對(duì)昆蟲鈉離子通道與抗藥性關(guān)系的研究主要集中于昆蟲對(duì)擬除蟲菊酯的擊倒抗性。棉鈴蟲Helicoverpa armigera(Hübner)是一種重要的棉花害蟲，許多國(guó)家的棉鈴蟲都對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性。赤擬谷盜Tribolium castaneum是鞘翅目重要儲(chǔ)糧害蟲，也是除黑腹果蠅Drosophila mel

2、anogaster、岡比亞按蚊Anopheles gambiae、家蠶Bombyx mori外第4個(gè)被全基因組測(cè)序的昆蟲。本文克隆了棉鈴蟲和赤擬谷盜鈉離子通道基因，并分析了其在不同發(fā)育階段的mRNA表達(dá)水平，比較了其基因組結(jié)構(gòu)和選擇性剪接位點(diǎn)，研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步明確昆蟲鈉離子通道的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系以及新型高效殺蟲劑的創(chuàng)制具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。
　　通過RT-PCR技術(shù)克隆了棉鈴蟲和赤擬谷盜鈉離子通道基因全長(zhǎng)cDNA序列，Ha

3、Nav和TcNav。HaNav開放閱讀框長(zhǎng)6168bp，編碼2055個(gè)氨基酸殘基;TcNav開放閱讀框長(zhǎng)6138bp，編碼2045個(gè)氨基酸殘基。HaNav和TcNav氨基酸序列的一致性為76％，HaNav、TcNav與黑腹果蠅鈉離子通道基因para氨基酸序列的一致性都為75％。HaNav和TcNav與已知昆蟲鈉離子通道具有共同的結(jié)構(gòu)特征，包括4個(gè)典型的同源結(jié)構(gòu)域(Ⅰ-Ⅳ)，每個(gè)結(jié)構(gòu)域含6個(gè)跨膜片段(S1-S6)。決定離子選擇性的重要基序

4、DEKA（分別位于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ同源結(jié)構(gòu)域S5和S6連接環(huán)）在HaNav(D385，E997，K1517，A1810)和TcNav(D387，E988，K1492，A1785)中高度保守，而在鈉離子通道快速失活中起著重要作用的位于同源結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅳ之間的疏水性MFM基序也存在于HaNav(1584-1586)和TcNav（1559-1561）中。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步對(duì)HaNav和TcNav的mRNA表達(dá)水平的分析發(fā)現(xiàn)，HaNav和

5、TcNav在棉鈴蟲和赤擬谷盜不同發(fā)育階段的表達(dá)水平存在一定差異。
　　基因組結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，HaNav和鱗翅目昆蟲煙芽夜蛾Heliothis virescens、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella及家蠶鈉離子通道基因相似，含有33個(gè)外顯子。與HaNav相比，TcNav含有26個(gè)外顯孑，對(duì)應(yīng)HaNav外顯子8-10，22-25，30-31，32-33分別合并為一個(gè)外顯子。HaNav和TcNav的外顯子序列一致性為43-87％。

6、盡管HaNav和TcNav的15個(gè)外顯子長(zhǎng)度完全相同，但兩者內(nèi)含子長(zhǎng)度差異較大，HaNav的內(nèi)含子平均長(zhǎng)度是TcNav的4.7倍。除了TcNav第12內(nèi)含子5'剪接位點(diǎn)為GC外，HaNav和TcNav內(nèi)含子都具有保守的5'剪接位點(diǎn)GT和3'剪接位點(diǎn)AG。
　　對(duì)cDNA克隆的多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，HaNav和TcNav存在多個(gè)選擇性剪接位點(diǎn)。在HaNav中，對(duì)應(yīng)著黑腹果蠅para選擇性剪接位點(diǎn)j、i和f，外顯子2，外顯子11的3'端和

7、外顯子21的5'端分別發(fā)生了外顯子跳躍、選擇性3'剪接和選擇性5'剪接，兩對(duì)互斥外顯子18a/b和26a/b分別與para的c/d和l/k相對(duì)應(yīng)，對(duì)應(yīng)para選擇性剪接位點(diǎn)a和b的外顯子12、16的5'端存在于所有克隆中，但e和h在HaNav中未發(fā)現(xiàn)。在TcNav中，對(duì)應(yīng)著para選擇性剪接位點(diǎn)j和i，外顯子2，外顯子9的3'端分別發(fā)生了外顯子跳躍、選擇性3'剪接，對(duì)應(yīng)para選擇性剪接位點(diǎn)a的外顯子10的5'端存在于所有克隆中，但e和