小菜蛾GABA受體基因克隆及棉鈴蟲羧酸酯酶的功能表達.pdf

1、該博士論文為本人碩博連讀期間所傲內(nèi)容，總體分為兩部分，其中“小菜蛾GABA受體基因克隆”部分的內(nèi)容主要在碩士階段完成，“棉鈴蟲羧酸酯酶的功能表達”部分的內(nèi)容由國家留學(xué)基金委聯(lián)合培養(yǎng)博士生項目資助在澳大利亞CSIRO昆蟲所完成．
　　 1．小菜蛾GABA受體基因cDNA全長的克隆及序列分析
　　 采用RT-PCR和RACE技術(shù)從小菜蛾中克隆得到GABA受體兩個亞基基因，即PxGABARal和PxGABARa2．PxGABA

2、Ral的cDNA編碼區(qū)長1458bp，編碼485個氨基酸；PxGABARa2的cDNA編碼區(qū)長1563bp，編碼520個氨基酸。兩個亞基均含有保守的四個跨膜區(qū)及半胱氨酸橋。黑腹果蠅Rdl基因直系同源A302S突變位點處，PxGABARal為A282，PxGABARa2為S285。分別對兩亞基的氨基酸序列在GenBank中進行BLAST同源性搜索，發(fā)現(xiàn)PxGABARal與其它GABA受體a亞基顯示了較高的相似性：煙芽夜蛾a3亞基(AF00

3、6192，95％)，煙芽夜蛾的a2亞基(AJ224513，85%)、黑腹果蠅Rdl亞基(AAF50311，84%)、小菜蛾a2亞基(FJ665610，83%)、家蠶a亞基(EF521821，81%)。PxGABARa2與其它GABA受體a亞基一致性為：煙芽夜蛾a2亞基(AJ224513，91%)、甜菜夜蛾a2亞基(ABQ45398，87%)、家蠶a亞基(EF521821，84%)、煙芽夜蛾的a3亞基(AF006192，83%)，黑腹果蠅

4、Rdl亞基（AAF50311，77%）。兩亞基在第三外顯子都存在兩種可變剪接形式，在第六外顯子均為同一種剪接形式。
　　 2．小菜蛾GABA受體亞基基因組結(jié)構(gòu)及其基因定位
　　 在已知小菜蛾P(guān)xGABARal和PxGABARa2基因cDNA序列的基礎(chǔ)上設(shè)計引物，利用染色體步移及常規(guī)PCR技術(shù)擴增得到小菜蛾P(guān)xGABARal和PxGABARa2除第一內(nèi)含子外的基因組序列，兩基因均包含9個內(nèi)含子，內(nèi)含子一外顯子邊界符合GT-

5、AG規(guī)則，內(nèi)含子插入位點相同，且內(nèi)含子相高度一致，表明這兩個基因可能起源于近期的基因復(fù)制事件。為了確定兩個基因是否位于Z染色體上，分別采用兩種分子標(biāo)記對SZ-Diel品系雌性（ZSerW）和ROTH品系雄性小菜蛾(ZAlaZAla)單對雜交F1代進行了基因型檢測。對于PxGABARa1，66個雜交F1代個體中，33個雌性個體為A282半合子，33個雄性個體為A/S282雜合子，這表明PxGABARa1位于Z染色體；對于小菜蛾P(guān)xGABA

6、Ra2，34個雜交F1代個體中，15個雌性個體均只有一條長的條帶，與父本(ROTH)一致；19個雄性個體均同時有長、短兩條條帶，一個來自父本(ROTH)另外一個來自母本(SZ-Diel)，證明了小菜蛾P(guān)xGABARa2基因也位于Z染色體上。
　　 3．小菜蛾P(guān)xGABARa1亞基A282S突變與狄氏劑及氟蟲腈抗性關(guān)系
　　 為了明確小菜蛾P(guān)xGABARa1亞基A282S在狄氏劑及氟蟲腈抗性中的作用，通過單對雜交分別建立了

7、含有A282S突變純合子的氟蟲腈抗性品系SZ-FSer及狄氏劑抗性品系SZ-DielSer，并建立小菜蛾氟蟲腈抗性近等基因系SZ-FAla。SZ-FSer相對與洛桑敏感品系ROTH和深圳對照品系SZ，對氟蟲腈抗性倍數(shù)分別為208.43和182.75倍；對狄氏劑、硫丹、林丹有低水平的交互抗性，抗性倍數(shù)分別為6.4、1.89和5.81，對阿維菌素和多殺菌素沒有交互抗性。SZ-DielSer相對于洛桑敏感品系ROTH和深圳對照品系SZ對狄氏劑

8、分別有9.3和6.52倍的抗性；對氟蟲腈、硫丹、林丹有低水平的交互抗性，抗性倍數(shù)分別為10.91、6.07和8.95，對阿維菌素及多殺菌素沒有交互抗性。SZ-FAla相對于洛桑敏感品系ROTH和深圳對照品系SZ對氟蟲腈的抗性分別為101.20和88.73倍，對狄氏劑和硫丹不存在交互抗性。
　　 SZ-Fser、SZ-DielSer及SZ-FAla品系相對于SZ品系對狄氏劑的抗性倍數(shù)分別為6.4、6.52和1.34; SZ-FSe

9、r、SZ-DielSer相對于SZ-FAla品系對狄氏劑的抗性分別為4.77、4.86倍；SZ-FSer品系相對于SZ-FAla品系對氟蟲腈的抗性倍數(shù)為2.06，從而表明小菜蛾P(guān)xGABARa1基因A282S突變是小菜蛾狄氏劑抗性的主要因子，是小菜氟蟲腈抗性的次要因子。
　　 鑒定了SZ-DielSer品系與敏感品系ROTH正反交F1代不同藥劑處理后存活個體雌、雄蟲的基因型，正交F1代雄蟲（ZSerZAla）、雌蟲（ZAlaW）

10、及反交F1代雄蟲（ZSerZla）、雌蟲(ZSerW)的存活比例如下：1.5ppm氟蟲腈處理后分別為8.5%、6.5%和9%、10.1%；600ppm狄氏劑處理后分別為6.5%、全部死亡和5%、16.5%；1，500ppm硫丹處理后分別為11%、2.5%和13.5%、15.5%。該結(jié)果進一步證明了小菜蛾P(guān)xGABARa1基因A282S突變是狄氏劑抗性的主要因子，是氟蟲腈、硫丹抗性的次要因子，同時也證明小菜蛾狄氏劑抗性與Z染色體連鎖。

11、r>　　 4．棉鈴蟲羧酸酯酶基因在昆蟲細胞中的異源表達
　　 利用Gateway技術(shù)將棉鈴蟲YG和YGF品系的羧酸酯酶CCE001a、CCE001c、CCE001d、CCE001i、CCE001j重組至入門載體，獲得入門克隆。對兩個品系中的五個基因氨基酸序列分析表明，均具有保守的胱氨酸環(huán)、氧負離子孔(GG)及由Ser、Glu和His構(gòu)成的催化三聯(lián)體，多個位點存在氨基酸多態(tài)性；與銅綠麗蠅（L.cuprina）aE7基因E3的G1

12、37等同位點沒有G137D突變，E3 W251等同位點處，CCE001c及CCE001i在YG和YGF品系里均是L，與銅綠麗蠅E3該位點突變型相同。CCE001i在YG品系中靠近C端有四個氨基酸的插入，重組病毒成功轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細胞，羧酸酯酶活性初步檢測顯示，除YG品系中的CCE001i外，其余均檢測到了活性．利用熒光定量PCR測定了各重組病毒滴度，在昆蟲細胞中對來自YG和YGF品系的羧酸酯酶CCE001a、CCE001c、CCE001

13、d、CCE001i、CCE001j進行了異源表達。
　　 5．棉鈴蟲羧酸酯酶重組蛋白有機磷水解活性及羧酸酯酶活性的測定
　　 以熒光化合物dEUP和dMUP對棉鈴蟲羧酸酯酶重組酶蛋白有機磷水解活性及其摩爾濃度進行了測定。棉鈴蟲所有羧酸酯酶重組蛋白有機磷水解活性，沒有出現(xiàn)像E3突變后有機磷活性顯著升高的情況。相對于E3 WT，僅部分棉鈴蟲羧酸酯酶重組蛋白的有機磷活性升高。001d對dEUP和dMUP的Kcat值比較接近，而

14、001a、001c，001i、001j則更偏向于水解dMUP，其Kcat值為dEUP的1.8到4.6倍，這種偏好于水解dMUP的特性與銅綠麗蠅E3 W251L相似，001c和001i在兩品系中E3 W251L等同位點為L，而001a、001j則為F。從而表明，該位點為L并不是造成這種偏向性的必要條件。
　　 棉鈴蟲羧酸酯酶重組蛋白對a-NA有較p-NPA高的底物特異性。001a、001j、001d對α-NA有著較高催化活性的，其

15、與E3 W251L等同位點為F；001c、00li催化活性，較低，與E3 W251L等同位點為L，因此，棉鈴蟲羧酸酯酶重組蛋白a-NA水解活性的差異可能與該位點氨基酸差異相關(guān)。001a、001j對a-NA的催化效率在兩品系間差異不顯著，001c、001d在兩品系間差異顯著，YGF品系約為YG品系的2倍和1.5倍。001c、001j對p-NPA催化效率在兩品系中差異顯著。001a、001d、001j對α-NA的底物親和性相對較高，由此推測

16、，001a、001d、001j較高的底物親和特性可能通過對擬除蟲菊酯的阻隔作用在抗性中發(fā)揮作用。
　　 6．棉鈴蟲羧酸酯酶重組蛋白對擬除蟲菊酯及其熒光類似物的代謝
　　 為了了解棉鈴蟲羧酸酯酶對擬除蟲菊酯水解活性，本研究分別測定了棉鈴蟲羧酸酯酶重組蛋白對氯氰菊酯、氰戊菊酯及其熒光類似物各異構(gòu)體的水解活性。棉鈴蟲羧酸酯酶重組蛋白對氯氰菊酯及氰戊菊酯熒光類似物各異構(gòu)體的活性測定表明：對氯氰菊酯各立體異構(gòu)體的水解活性存在立體選

17、擇性，即：trans>cis、1(S)>1(R)。總的來看，對l(S)trans-α(S)和1(R)trans-α(R)的活性最高，對其異構(gòu)體它異構(gòu)體活性相對較低甚至檢測不到。對氰戊菊酯各立體異構(gòu)體優(yōu)先水解酸基團為2R構(gòu)型的異構(gòu)體，與E3 WT相比，001a、001d、001j對各異構(gòu)體水解活性有明顯升高，001c僅對個別異構(gòu)體有較低的活性。棉鈴蟲羧酸酯酶重組蛋白對氯氰菊酯各異構(gòu)體及順式氰戊菊酯的活性測定表明：對氯氰菊酯各異構(gòu)體的水解具