斜紋夜蛾QM和PDI基因的克隆、表達及其對萊氏野村菌的免疫應(yīng)答分析.pdf

1、斜紋夜蛾（Spodoptera litura Fabricius）是世界性分布的暴食性農(nóng)業(yè)重大害蟲，主要在我國黃河和長江流域嚴重發(fā)生。幼蟲取食危害十字花科蔬菜類植物，寄主范圍多達99科290種以上。鑒于長期濫用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致蔬菜農(nóng)殘超標，害蟲抗藥性增強、生態(tài)失衡等諸多問題，微生物農(nóng)藥為主的生物防治受到空前重視。萊氏野村菌（Nomuraea rileyi）是田間可以引起斜紋夜蛾流行性病害的有價值的蟲生真菌之一。研究斜紋夜蛾對萊氏野村菌入侵的

2、免疫應(yīng)答分子機理，對于研制更有效的防治斜紋夜蛾的萊氏野村菌真菌劑具有非常重要的意義。本課題基于斜紋夜蛾脂肪體抑制差減雜交文庫（suppression subtractive hybridization，SSH）篩選到的QM，PDI基因的EST序列著手，分別對兩個基因進行克隆并研究其與斜紋夜蛾對萊氏野村菌入侵的應(yīng)答關(guān)系。主要研究結(jié)果：
　　（1）關(guān)于斜紋夜蛾QM基因的研究結(jié)果：
　?、倩谛奔y夜蛾QM基因的EST序列，采用SM

3、ART RACE RT-PCR技術(shù)克隆該基因的cDNA全長，運用ORF finder，SMART和Expasy等軟件推斷其氨基酸序列并分析蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)以及蛋白結(jié)構(gòu)，利用MegAlign程序?qū)Σ煌锓N的QM進行同源性計算，并通過Clustalw和MEGA軟件進行多序列分析并構(gòu)建QM基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果表明斜紋夜蛾QM基因cDNA全長838bp（并命名為SpLQM），含有660bp的ORF，編碼219個氨基酸，預(yù)測其蛋白的分子量

4、為25.6KDa，等電點為10.0；蛋白功能位點預(yù)測，該蛋白含蛋白酶C磷酸化位點、N-?；稽c和酰胺化等位點；既沒有信號肽也沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。同源性比較與進化分析發(fā)現(xiàn)，斜紋夜蛾QM蛋白與甜菜夜蛾和粘蟲的親緣最近，氨基酸序列相似性分別高達99.1％和97.7%；與單細胞真菌酵母的進化關(guān)系最遠，但同源性也達到60.8%，說明QM蛋白具有進化的保守性；多序列比對顯示QM蛋白家族的含有SH3結(jié)合序列和L10核糖體信號肽均很保守，N端比C端保守。

5、基因組結(jié)構(gòu)分析顯示，SpLQM基因含有三個內(nèi)含子。
　?、谕ㄟ^半定量RT-PCT和熒光定量RT-qPCR的技術(shù)檢測了SpLQM基因在斜紋夜蛾各組織的表達特性，結(jié)果表明該基因在所選組織中均有表達，其中在血細胞中表達量最高，是頭部的58倍；脂肪體次之，為頭部的8倍；在表皮表達量最低。
　?、凼占蝗R氏野村菌孢子誘導(dǎo)后的斜紋夜蛾血液觀察發(fā)現(xiàn)，孢子在注入血腔24h還未發(fā)芽，注射48h后開始快速繁殖，而注射72h后不僅形成的蟲菌體迅速

6、繁殖外，而且血細胞遭破壞變得不完整。同時，采用RT-qPCR技術(shù)進行誘導(dǎo)后表達特性研究，結(jié)果顯示，SpLQM在脂肪體、血組織和中腸中的mRNA表達量均有不同程度的增加：在脂肪體中，注射后的6h~12h開始呈上升趨勢，到24h表達量達到最大(為0h的4.6倍），48h開始回落；而在血細胞中，表達量6h開始上升，到12h達到最大(為0h的3.3倍)，24h~48h表達量逐漸降低；在中腸組織中也有上調(diào)趨勢，只是增加幅度沒有在脂肪體和血組織中的

7、大。
　?、芊治雒盖形稽c后重新設(shè)計引物克隆，以pET30(a)為表達載體，構(gòu)建pET30a-SpLQM重組表達質(zhì)粒，并測序驗證。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)pLYsS感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)該基因以包涵體形式表達，并以切膠回收進行初步純化，Western blotting鑒定證實SpLQM基因在大腸桿菌中正確表達并得以初步純化。
　?。?）關(guān)于斜紋夜蛾P(guān)DI基因的研究

8、結(jié)果：
　?、俑鶕?jù)篩選的斜紋夜蛾P(guān)DI基因EST序列，采用SMARTRACERT-PCR技術(shù)克隆獲得該基因的cDNA全長，通過上述的軟件進行一系列生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示斜紋夜蛾P(guān)DI基因cDNA全長為2367bp(并命名為SpLPDI)，包含一個1485bp的ORF，編碼494個氨基酸，預(yù)測分子量為55.3KDa；SpLPDI蛋白含有一個17個氨基酸殘基的信號肽，兩個硫氧還蛋白（-CGHC-）的催化活性域和一個RDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位

9、信號肽，且具有典型的PDI蛋白家族的a-b-b’-a’-c結(jié)構(gòu)特點；對序列對比分析發(fā)現(xiàn)該蛋白在a和a’結(jié)構(gòu)中的CGHC的催化核心序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號肽均極為保守；進化樹分析表明，SpLPDI蛋白屬于第Ⅰ類PDI蛋白簇中，且與家蠶同源性最高為83.0%，與原生動物的隱孢子蟲與黑曲霉的親緣關(guān)系較遠。
　?、诶冒攵縍T-PCR對不同組織SpLPDI的進行組織分布分析，并進一步通過熒光定量RT-qPCR對其組織差異性分析。結(jié)果表明，S

10、pLPDI在檢測的組織中均有表達，但在血液中相對表達量最高，是頭部表達量的110倍；脂肪體次之，是頭部的41倍；在頭部表達量最低。這可能與SpLPDI蛋白在這些組織執(zhí)行某些特殊功能有關(guān)。
　?、壅T導(dǎo)表達分析表明，在萊氏野村菌誘導(dǎo)后SpLPDI在脂肪體和中腸中表達均有上調(diào)現(xiàn)象，在脂肪體中誘導(dǎo)后24h相對表達量達到最大，而中腸中12h相對表達量達到最大，48h相對表達量均有回落，但是在脂肪體的上調(diào)幅度比中腸的大，這可能與真菌入侵的免疫

11、調(diào)控活動有關(guān)。
　?、苋コ盘栯慕Y(jié)合酶切位點分析重新設(shè)計引物克隆，以pET30(a)為表達載體，構(gòu)建pET30a-SpLPDI重組表達質(zhì)粒，并測序驗證。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)pLYsS感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)該基因以可溶形式表達，并通過Ni-NTA親和層析柱純化，獲得比較純?nèi)诤系鞍?，除去標簽與預(yù)測分子量基本一致。
　　結(jié)論：首次克隆出斜紋夜蛾SpLQM基因與Sp