萊氏野村菌NrCccA和NrCccB基因的克隆與功能研究.pdf

1、萊氏野村菌（Nomuraea rileyi）作為主要的生防真菌防治斜紋夜蛾等害蟲具有明顯優(yōu)勢(shì)因而受到人們的關(guān)注，但由于萊氏野村菌產(chǎn)孢條件苛刻，分生孢子抗逆性差、存儲(chǔ)期短、防效不穩(wěn)定等缺點(diǎn)限制了其大規(guī)模的生產(chǎn)和應(yīng)用。研究證實(shí)微菌核可以替代分生孢子作為有效的活性成分，并且微菌核與分生孢子相比具有抗逆性強(qiáng)，耐儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)。前期研究發(fā)現(xiàn)高濃度的鐵元素有利于微菌核的形成，因此研究萊氏野村菌的鐵儲(chǔ)存和代謝對(duì)于進(jìn)一步明確萊氏野村菌微菌核形成的分子機(jī)理具

2、有重要意義。
　　本文首先克隆了萊氏野村菌中的液泡鐵轉(zhuǎn)運(yùn)因子NrCccA和NrCccB的編碼基因。在不同濃度鐵離子存在條件下各基因的表達(dá)特征分析，發(fā)現(xiàn)微菌核形成過程中在100mg/L FeSO4中NrCccA和NrCccB基因的表達(dá)量最高。在高鐵濃度誘導(dǎo)下，NrCccA基因短時(shí)間內(nèi)大量表達(dá)。微菌核形成過程中表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn) NrCccA和NrCccB基因隨著微菌核的形成表達(dá)量逐漸上升。
　　生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NrCccA和Nr

3、CccB基因全長分別為819bp和828bp，兩個(gè)基因無內(nèi)含子，分別編碼272和275個(gè)氨基酸；等電點(diǎn)分別為6.71、4.73；分別編碼的多肽分子量為29.3KDa、29.5KDa，NrCccA蛋白含有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，且沒有信號(hào)肽，NrCccB蛋白含有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，無信號(hào)肽。蛋白同源序列比對(duì)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示NrCccA和NrCccB蛋白均屬于Ccc1-like家族，兩者為同源序列，可能發(fā)揮相似的功能。蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果

4、顯示：NrCccA和NrCccB蛋白與綠僵菌屬（Metarhizium anisopliae）和厚孢普可尼亞菌（Pochonia chlamydosporia）親緣關(guān)系較近。
　　采用同源重組策略進(jìn)行這兩個(gè)基因的單敲除得到了NrCccA和NrCccB基因的敲除突變體。各敲除突變體的表型結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)NrCccA敲除轉(zhuǎn)化子鐵離子耐受性降低。NrCccA和NrCccB突變菌株的剛果紅抗逆性顯著降低，對(duì)H2O2、高滲透壓以及Mn2+、Ca

5、2+、Zn2+、Cu2+以及SDS、山梨醇抗逆性無影響。NrCccA和NrCccB敲除突變體的分生孢子萌發(fā)率顯著下降。NrCccA和NrCccB突變菌株微菌核形成過程中生物量和微菌核形成數(shù)量稍有下降；但NrCccA和NrCccB敲除突變體微菌核干燥后吸水萌發(fā)速率以及產(chǎn)孢量顯著降低。NrCccA和NrCccB敲除突變體無毒力變化。
　　在微菌核形成過程以及高鐵濃度誘導(dǎo)下，NrCccA基因缺乏，NrCccB基因的表達(dá)量稍有下調(diào)，NrC

6、ccB缺乏，NrCccA在微菌核形成過程中稍有下調(diào)，但在高鐵濃度誘導(dǎo)下，NrCccA顯著上調(diào)表達(dá)。NrCccA和NrCccB突變菌株中控制鐵載體合成基因NrSidA和線粒體內(nèi)利用鐵離子相關(guān)基因NrMrs3的表達(dá)特征分析發(fā)現(xiàn)，NrCccA和NrCccB缺乏，引起NrSidA和NrMrs3基因的上調(diào)表達(dá)。
　　綜上所述，NrCccA和NrCccB基因在微菌核形成、抗逆性以及萌發(fā)方面發(fā)揮重要的作用，NrCccA能夠應(yīng)對(duì)高鐵刺激，且與Nr