綠僵菌致病相關(guān)基因Mzbot的克隆和功能研究.pdf

1、綠僵菌（Metarhiziumanisopliae）又名黑僵菌，是一種常見的絲狀真菌，有著廣泛的地理分布，也是國(guó)內(nèi)外生物防治中應(yīng)用廣泛的昆蟲病原真菌之一。綠僵菌具有一定的專一性，對(duì)人畜無害，同時(shí)還具有不污染環(huán)境、無殘留、害蟲不會(huì)產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。隨著綠僵菌基因組測(cè)序的完成，使其更成為一種研究蟲生真菌的模式生物。迄今，關(guān)于真菌的致病機(jī)制的研究廣泛，而關(guān)于蟲生真菌致病相關(guān)基因的研究亦十分活躍。這是由于綠僵菌致病力弱，貨架期短，環(huán)境依賴性強(qiáng)嚴(yán)

2、重制約了綠僵菌殺蟲真菌農(nóng)藥的發(fā)展。致病基因、耐脅迫基因的研究將為菌株改造提供基因資源。
　　本實(shí)驗(yàn)從綠僵菌CQMa102在蝗蟲翅膀生長(zhǎng)時(shí)期與在蝗蟲體內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)期的差減cDNA文庫中選取了一個(gè)高表達(dá)基因EST序列，WTEA78。根據(jù)這個(gè)EST序列，我們從綠僵菌全長(zhǎng)cDNA文庫中克隆了這個(gè)基因Mzbot，該基因cDNA序列全長(zhǎng)1251bp，與費(fèi)希新薩托菌的zinc-bindingoxidoreductaseToxD基因具有較高的同源性，

3、同時(shí)利用RNAi和超表達(dá)的方法，通過減少或增加基因的表達(dá)量后綠僵菌變異表型，研究了Mzbot的功能。得到的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1．綠僵菌Mzbot基因的克隆、序列分析和表達(dá)情況
　　克隆了蝗蟲翅膀上特異高表達(dá)基因Mzbot的cDNA全長(zhǎng)，進(jìn)行了生物信息分析，并通過RT-PCR對(duì)其侵染蝗蟲過程中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。
　　Mzbot基因cDNA片段全長(zhǎng)1251bp，包括一個(gè)1089bp的開放閱讀框，69bp的5’非翻

4、譯區(qū)，93bp的3’非翻譯區(qū)。該cDNA序列的Genebankaccessionnumber為HQ011919。與綠僵菌CQMa102全基因組序列比對(duì)，獲取了Mzbot基因的基因組DNA序列。將DNA序列與cDNA序列用DNAMAN軟件比對(duì)，結(jié)果表明：Mzbot基因組DNA全長(zhǎng)1478bp，含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子位置為（283bp-381bp、661bp-715bp、800bp-866bp），其邊界皆符合GT-AG規(guī)則。

5、r>　　在線預(yù)測(cè)該基因編碼362個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量Mw=39336.81u（當(dāng)Cys處于還原狀態(tài)時(shí)）；理論等電點(diǎn)pI=5.41屬于酸性蛋白質(zhì)；其分子式為C1786H2772N456O530S7；負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)47個(gè)，正電荷殘基(Arg+Lys)39個(gè)，平均親水性(GRAVY):-0.135，是一個(gè)親水蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)(Instabilityindex)19.67，為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。同費(fèi)希新薩托菌的zinc-bindi

6、ngoxidoreductaseToxD基因具有較高的同源性（51％identity，E-Value值為6e-85）。與其他真菌已知或推測(cè)的zinc-bindingoxidoreductaseToxD也有較高的同源性。在線分析推測(cè)編碼蛋白不含有信號(hào)肽，沒有定向到線粒體的導(dǎo)肽，也沒有核定位信號(hào)NuclearLocalizationSignals(NLS)，定位在細(xì)胞質(zhì)。
　　生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明該蛋白沒有顯著的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，這與生物信

7、息學(xué)定位一致，在163位氨基酸處（NKTV）有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(N-glycosylationsite)；在12與223位氨基酸處（RKAT）各有一個(gè)cAMP-與cGMP-依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)；在195、242、251位氨基酸處（SSK）各有一個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)；在27位（TLPD）、48位（TTLD）、67位（TVEE）、159位（SQDD）、217位（TVGE）、269位（SDVE）、298位（TYYE）分別具有酪蛋白激酶

8、II磷酸化位點(diǎn)；在57位（GTLVGC）、91位（GGNDAR）、170位（GGSTAT）、255位（GTYVNL）、329位（GGLIGV）各有一個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)。
　　結(jié)構(gòu)域分析預(yù)測(cè)表明該基因編碼的假定蛋白zinc-bindingoxidoreductaseToxDN-端具有一個(gè)GroES-like功能結(jié)構(gòu)域，在C-端具有NAD(P)結(jié)合功能結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域在所有的ToxD蛋白中都具有，是一個(gè)突出的特征。這一點(diǎn)預(yù)示

9、了基因編碼蛋白的氧化還原特性，可能參與了生命體的抗氧化保護(hù)機(jī)制。
　　RT-PCR檢測(cè)該基因在綠僵菌侵染蝗蟲過程中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示該基因在體內(nèi)、體外兩個(gè)侵染階段存在比較大的表達(dá)差異。28℃恒溫恒濕的條件下，在綠僵菌侵染蝗蟲體表15h后該基因持續(xù)而強(qiáng)烈的表達(dá)，而綠僵菌在蝗蟲血淋巴中該基因表達(dá)甚微。推測(cè)該基因的主要作用可能是綠僵菌適應(yīng)蝗蟲翅膀環(huán)境，可能與抵抗脅迫因素有關(guān)。
　　2．綠僵菌Mzbot基因的干擾、超表達(dá)和在突變株

10、中的表達(dá)情況
　　利用RNAi和超表達(dá)的方法對(duì)基因Mzbot進(jìn)行功能研究。干擾片段連接至RNA干擾載體（pbar-RNAi-gpd-trp）和全長(zhǎng)基因連至超表達(dá)載體后，采用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化綠僵菌CQMa102，經(jīng)過PPT（草丁膦）和PCR篩選鑒定，各獲得4個(gè)Mzbot基因的干擾突變株和超表達(dá)突變株。采用RT-PCR的方法檢測(cè)各個(gè)突變株中Mzbot基因的表達(dá)情況。分析結(jié)果顯示，干擾突變株和超表達(dá)突變株中的該基因的表達(dá)均有較大的變化，

11、選取其中變化最大的突變株作了進(jìn)一步表型分析。3．綠僵菌Mzbot基因的干擾、超表達(dá)后的表型變異分析
　　分析了干擾突變株和超表達(dá)突變株在1/4SDAY培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。在正常培養(yǎng)基1/4SDAY上，干擾突變株菌落呈現(xiàn)中央同菌落四周斷裂的表型，而野生菌株與超表達(dá)菌株均呈現(xiàn)中央凸起的菌落表型，且野生株與超表達(dá)菌株菌落沒有可見的明顯差異。這可能是Mzbot基因?qū)ρ趸瘔毫Φ恼{(diào)控導(dǎo)致了菌落表型的變異，ROS的水平變化發(fā)揮了重要作用。

12、>　　對(duì)兩種突變株進(jìn)行了抗逆性分析，兩種突變株在不同的pH和滲透壓條件下，菌落表型與野生株沒有明顯差異，而抵抗氧化壓力的能力與野生株具有顯著的差別，干擾突變株的生長(zhǎng)受到更厲害的抑制，而超表達(dá)突變株表現(xiàn)了更強(qiáng)的對(duì)氧化的抗性。這表明，Mzbot基因參與了綠僵菌CQMa102對(duì)氧化壓力的抗性，而沒有影響菌株對(duì)pH和滲透壓的抗逆能力。
　　對(duì)兩種突變株孢子的毒力進(jìn)行了生物測(cè)定，干擾突變株的LT50和野生株的LT50差異極顯著（P<0.01