羅伯茨綠僵菌小柱孢酮脫水酶基因的功能研究.pdf

1、農(nóng)業(yè)害蟲的防治始終是人們亟待解決的難題，目前微生物農(nóng)藥以生物防治生物且具有安全，無污染等特點，而受到人們越來越多的關(guān)注。在微生物農(nóng)藥中，以昆蟲病原真菌為主的殺蟲劑在害蟲生物防治中起重要作用，昆蟲病原真菌的研究也日益成為人們的研究熱點。羅伯茨綠僵菌(Metarhizium robertsii)作為蟲生真菌的模式生物，在蟲生真菌的代謝調(diào)控，致病機理等研究中起著重要的作用。DHN（1，8-dihydroxynaphthalene）黑色素合成途

2、徑存在于大部分真菌中，且與真菌的致病力，抵御不利條件有著密切的關(guān)系，其中小柱孢酮脫水酶(SCD，scytalone dehydratase)基因是DHN黑色素合成途徑中的一個關(guān)鍵基因。前期研究表明綠僵菌中可能不存在DHN黑色素合成途徑，且關(guān)于綠僵菌中的色素合成途徑仍需要進一步的研究。
　　本研究以綠僵菌為研究對象，通過NCBI查找得到綠僵菌的SCD基因序列，及其上下游基因序列，設(shè)計合適的引物,通過酶切連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)

3、入農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的同源轉(zhuǎn)化機制，獲得SCD陽性敲除株及相應(yīng)的回補株;最后通過比較敲除株與野生型之間的表型差異，分析SCD基因的功能。具體研究結(jié)果如下:
　　(1)通過NCBI查找得到羅伯茨綠僵菌的SCD基因序列，及其上下游基因序列，得到相應(yīng)的重組質(zhì)粒。
　　(2)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因敲除方法獲得SCD的敲除突變株;同時用相同的方法，獲得敲除株的回補株。
　　(3)對野生型，敲除株，回補株進行相關(guān)的生物學(xué)特性實驗

4、，比較分析敲除株與野生型，回補株之間的表型差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn):
　　1)與野生型羅伯茨綠僵菌相比，SCD敲除株菌落邊緣圓滑規(guī)則，菌絲向四周呈現(xiàn)放射狀，菌落顏色和菌落大小也未發(fā)生改變，特別是在在PDA上生長的菌落孢子均呈現(xiàn)墨綠色，再次證明羅伯茨綠僵菌中不存在DHN黑色素合成途徑。
　　2)將野生型，敲除株，回補株分別接于PDA，SDAY，1/4SDAY培養(yǎng)基上，測量其生長直徑。與野生型和回補株綠僵菌相比，SCD敲除株在PDA,SD

5、AY，1/4SDAY培養(yǎng)基上的生長速率均未發(fā)生變化。
　　3)將野生型,敲除株，回補株的孢懸液分別等量接種于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12d后計算其孢子數(shù)。與野生型和回補株綠僵菌相比，SCD敲除株在PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量有了明顯的下降趨勢。
　　4)將野生型，敲除株，回補株的孢懸液點接于分別加有甲萘醌、剛果紅、多菌靈、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉、雙氧水的PDA培養(yǎng)基中，觀察記錄其生長情況。結(jié)果表明SCD基因與羅伯茨綠僵菌的抗殺菌劑能力

6、，抗氧化能力以及抗高滲能力無關(guān)，并且不參與羅伯茨綠僵菌細胞壁的相關(guān)合成。
　　5)將野生型，敲除株，回補株的孢子置于紫外燈下照射后，補足萌發(fā)液保濕培養(yǎng)，26h后觀察其萌發(fā)情況。與野生型羅伯茨綠僵菌相比，SCD敲除株對紫外的耐受能力有了明顯的下降趨勢。
　　6)將玉米蟲分別浸泡在野生型，敲除株，回補株的孢懸液中，之后于25℃飼養(yǎng)，觀察綠僵菌對玉米蟲的侵染情況。與野生型羅伯茨綠僵菌相比，SCD敲除株對玉米蟲的侵染能力沒有發(fā)生變化