羅伯茨綠僵菌金屬蛋白酶基因(mamp1)的功能分析.pdf

1、昆蟲病原真菌是昆蟲病原微生物中最大的一個(gè)類群，全世界已報(bào)道的昆蟲病原真菌有近1000多種，是自然界控制昆蟲種群數(shù)量的主要因素之一。綠僵菌（Metarhzium spp.）是一類重要的昆蟲病原真菌,目前已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于害蟲的防治中[1]。但是由于傳統(tǒng)的綠僵菌農(nóng)藥致病過(guò)程較長(zhǎng)、殺蟲較慢，不僅田間使用劑量大、成本高，而且防效易受環(huán)境影響，從而限制了綠僵菌殺蟲劑的進(jìn)一步大規(guī)模的應(yīng)用。
　　綠僵菌侵染昆蟲是一個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程，其蛋白酶在綠

2、僵菌入侵過(guò)程中起著重要的作用，是關(guān)鍵的毒力決定因子。目前在綠僵菌中研究較多的類枯草桿菌蛋白酶(Prl)、類胰凝乳蛋白酶(Pr2)。而金屬蛋白酶為綠僵菌侵染昆蟲早期分泌出的一種胞外蛋白酶，也是一種重要的毒力因子。本實(shí)驗(yàn)的前期研究表明，野生型羅伯茨綠僵菌(Mr23)熱激后所形成的的基因表達(dá)譜，金屬蛋白酶1（Mamp1）的基因表達(dá)上調(diào)幅度明顯，因此我們推斷羅伯茨綠僵菌在熱脅迫條件下，Mamp1在孢子的耐熱過(guò)程中起重要的作用[2]，且目前對(duì)Ma

3、mp1的毒力因子功能也未見進(jìn)行基因敲除驗(yàn)證。為了探討綠僵菌金屬蛋白酶的確切功能，本研究以野生型綠僵菌ARSEF23（Metarhizium robberstii）為出發(fā)菌株。通過(guò)RACE方法獲得5，和3，UTR，獲得完整的CDS序列，并對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。然后選用質(zhì)粒載體 pDHt-SK-Bar，通過(guò)酶切，連接和 PCR驗(yàn)證，構(gòu)建了含金屬蛋白酶1(Mamp1)基因序列的基因敲除載體pDHt-Bar-K。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化ATM

4、T及同源重組技術(shù)與羅伯茨綠僵菌(Mr23)進(jìn)行共培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了金屬蛋白酶1基因敲除。最后通過(guò)測(cè)定野生株和突變株在生長(zhǎng)速率，產(chǎn)孢量，逆境協(xié)迫和生物測(cè)定等表型差異，來(lái)確定該基因的確切功能。主要研究結(jié)果如下：
　　1、綠僵菌金屬蛋白酶基因的 CDS結(jié)構(gòu)和分析。序列分析表明，Mamp1由93bp的5，UTR，1942bp的開放閱讀框和105bp的3，UTR組成。開放閱讀框編碼的蛋白質(zhì)由611個(gè)氨基酸組成，分子量為68KDa，等電點(diǎn)為6.17

5、。BLAST分析現(xiàn)該基因與其它昆蟲病原真菌有較高的同源性。
　　2、綠僵菌金屬蛋白酶基因的功能。（1）侵染大蠟螟的毒力實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)實(shí)驗(yàn)孢子濃度分別為5×106、1×107 conidia/mL和2×107 conidia/mL，突變株的半致死時(shí)間LT50分別為8.77、7.8和5.4天，較野生菌半致死時(shí)間分別增加了19％，23.7%和24%，數(shù)據(jù)顯示Mamp1蛋白酶缺失突變株侵染大蠟螟的能力下降，毒力顯著下降，因此Mamp1對(duì)綠僵

6、菌的毒力起重要作用。（2）逆境脅迫實(shí)驗(yàn)表明，突變菌株對(duì)高溫（38℃）和紫外線的抗性下降較為明顯，孢子萌發(fā)率分別下降了約13.9%和18.5%；對(duì)其它幾種化學(xué)性物質(zhì)脅迫的反應(yīng)，如細(xì)胞壁干擾物質(zhì) SDS和Congo red，氧化類調(diào)節(jié)物質(zhì)H2O2和menadione(MND)，滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)NaCl,殺菌類物質(zhì)carbendazim(CBD)，敲除株菌落生長(zhǎng)直徑有不同程度的下降，較野生型菌株分別下降了約13.4%、8.4%、3.6%、6.2

7、%、16.9%、10.8%。因此金屬蛋白酶基因在綠僵菌抗逆過(guò)程中起一定的作用。（3）對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響實(shí)驗(yàn)顯示，PDA和PPDA培養(yǎng)基上其生長(zhǎng)速率與野生菌株無(wú)明顯差異，而在SDAY及1/4 SDAY培養(yǎng)基上，敲除株較野生菌株生長(zhǎng)速率增加了約12%和12.34%。在產(chǎn)孢量的測(cè)定過(guò)程中，最后的結(jié)果表明在PDA和1/4SDAY這兩種培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量無(wú)明顯差異，而在 SDAY培養(yǎng)基上，敲除株較野生菌株產(chǎn)孢量下降了約15%。因此金屬蛋白酶基因?qū)φ婢?/p>