蛇毒金屬蛋白酶結構與功能關系的研究.pdf

1、研究了皖南尖吻蝮蛇毒強出血金屬蛋白酶acutolysin A的生物學活性.除了具有引起動物皮下出血的活性外,它還具有降解纖維蛋白原,層粘連蛋白,纖粘連蛋白和明膠的蛋白水解活性.將acutolysin A的cDNA克隆進兩種原核表達載體pET-22b和pET-15b,并在大腸桿菌中以包含體的形式表達了兩個重組acutolysin A,分別為A-22b和A-15b.經(jīng)體外變性,復性處理后,A-22b具有明顯的出血活性,其最低出血劑量約8—1

2、0ug,但沒有對纖維蛋白原,層粘連蛋白,纖粘連蛋白和明膠的蛋白水解活性.與A-22b相比,A-15b既沒有出血活性,也沒有對這些蛋白的水解活性.將另一個來自巴西的非出血金屬蛋白酶(命名為BR)的cDNA也克隆進兩種表達載體pET-22b和pET-15b;在大腸桿菌中以包含體的形式表達了兩個重組BR,分別為BR-22b和BR-15b.經(jīng)同樣的變復性處理后,BR-22b和BR-15b均沒有出血活性,但卻具有降解纖維蛋白原和明膠的活性.BR-

3、22b和BR-15b沒有顯示出對層粘連蛋白和纖粘連蛋白的水解活性.在上述研究基礎之上,通過PCR方法構建了兩個嵌合體基因(分別為C1和C2);C1是由BR基因的5'端序列(330bp堿基)和acutolysin A的3'端序列(285bp堿基)構成的嵌合體基因;C2是由acutolysin A基因的5'端序列(324bp堿基)和BR的3'端序列(336bp堿基)構成的嵌合體基因.隨后將它們每個均克隆進兩個表達載體pET-22b和pET-

4、15b中,因此得到四個表達質粒,即pC1-22b,pC1-15b,pC2-22b和pC2-15b.在大腸桿菌中以包含體的形式表達了相應的四個重組蛋白,即C1-22b,C1-15b,C2-22b和C2-15b.經(jīng)同樣的變復性處理后,初步測定了這些重組蛋白的生物學活性.與BR-22b和BR-15b類似,C1-22b和C1-15b具有較強的纖維蛋白原水解活性和明膠水解活性,但都沒有出血活性.與A-22b相似,C2-22b具有出血活性但沒有對這

5、些蛋白的水解活性.與A-15b相似,C2-15b既沒有出血活性,也沒有對這些底物的水解活性.這些實驗結果暗示:蛇毒金屬蛋白酶的N端主亞結構域在出血活性上起關鍵作用并極大的影響酶對底物的選擇性.同時,將皖南尖吻蝮蛇毒弱出血金屬蛋白酶acutolysin C的cDNA克隆進表達載體pET-15b,并在大腸桿菌中以包含體的形式表達了重組acutolysin C,即C-15b.經(jīng)變復性處理后,C-15b的生物學行為與A-15b相似,即沒有表現(xiàn)出

6、血活性和對這些底物的蛋白水解活性.這間接暗示,蛇毒金屬蛋白酶的N端主亞結構域對其生物學活性產生重大影響.另外,用pET-15b載體在大腸桿菌中以包含體的形式分別表達了出血金屬蛋白酶acutolysin A的N端主亞結構域和C端的小亞結構域,其相應的重組蛋白分別為An-15b和Ac-15b.Ac-15b包含了酶的催化中心;而An-15b為主亞結構域的主體部分,不含有半胱氨酸殘基和酶的催化區(qū).經(jīng)變復性處理后,它們均不具有出血活性和對這些蛋白