雙型真菌萊氏野村菌Nrcdc24與Nrbem1基因的克隆和功能研究.pdf

1、萊氏野村菌是一種在自然界廣泛存在的能有效控制昆蟲種群的重要病原真菌。對(duì)鱗翅目夜蛾科害蟲有較強(qiáng)的感染力和致病力，萊氏野村菌殺蟲制劑的有效成分為分生孢子。在萊氏野村菌發(fā)酵生產(chǎn)中，它對(duì)碳源的要求較高、生長周期長、產(chǎn)孢量不高，且在培養(yǎng)過程中需要持續(xù)光照，限制了對(duì)該菌的推廣和應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)室通過液體發(fā)酵成功誘導(dǎo)出了抗逆性強(qiáng)、毒力與傳統(tǒng)的分生孢子沒有明顯差異且耐儲(chǔ)存的微菌核，成為了一個(gè)新的具有高效殺蟲活性的殺蟲制劑的有效成分。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基

2、AM誘導(dǎo)產(chǎn)生的微菌核是由菌絲體特化形成的休眠體構(gòu)造；而用比較轉(zhuǎn)錄組測序分析的方法證實(shí)，微菌核的形成是一種氧脅迫的過程，伴隨色素的累積、活性氧（ROS）的產(chǎn)生及大量功能基因的表達(dá)變化。對(duì)這一調(diào)控機(jī)制的深入研究可以讓我們更好的了解微菌核形成的分子特性，也可為后期對(duì)微菌核發(fā)酵生產(chǎn)及制劑的開發(fā)等提供理論參考依據(jù)。本論文根據(jù)萊氏野村菌比較轉(zhuǎn)錄組庫中的EST序列克隆得到了在微菌核形成期高表達(dá)的Nrcdc24與Nrbem1基因的全長序列，經(jīng)生物信息學(xué)

3、分析、基因在微菌核形成過程中的表達(dá)測定以及外源RNA干擾的方法證明了兩個(gè)基因的功能。主要研究結(jié)果如下：
　?、俨捎肧MARTRACERT-PCR技術(shù)獲得Nrcdc24與Nrbem1的cDNA和基因組全長序列，其ORF分別為3021bp和1689bp，各自編碼1006和562個(gè)氨基酸；
　?、趯?duì)目的基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析顯示，Nrcdc24編碼的蛋白含有與Rho家族結(jié)合的功能位點(diǎn)RhoGTP；Nrbem1含有兩個(gè)SH3（

4、SrcHomology3）結(jié)合位點(diǎn)以及一個(gè)磷酸肌醇結(jié)合位點(diǎn)（phoxhomology,PX）。此外，Nrcdc24與Nrbem1蛋白都有PB1（phoxandBem1）結(jié)合位點(diǎn)；通過對(duì)近緣物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)萊氏野村菌的Nrcdc24與Nrbem1蛋白與綠僵菌的親緣關(guān)系最近；
　　③顯微觀察萊氏野村菌液體培養(yǎng)形成微菌核過程發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)至84h左右時(shí)，培養(yǎng)基中極性生長的菌絲體開始局部縮聚，微菌核開始大量形成；采用實(shí)時(shí)熒光定量PC

5、R的方法對(duì)Nrcdc24與Nrbem1基因在微菌核不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Nrcdc24與Nrbem1均在微菌核大量形成初期（84h左右）表達(dá)量高；
　?、転榱诉M(jìn)一步研究Nrcdc24與Nrbem1基因在微菌核形成過程中所起到的作用，設(shè)計(jì)同源干擾片段，以eGFP干擾片段的干擾菌株作為陰性對(duì)照，采用外源RNAi的方法進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：在SMAY固體培養(yǎng)基上，Nrcdc24與Nrbem1干擾菌株（命名為cdc24RNAi和bem

6、1RNAi）的酵母態(tài)階段生長菌落比野生型（WT）和陰性對(duì)照（eGFP）的菌落生長相對(duì)緩慢，菌體由酵母態(tài)向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)化（兩型轉(zhuǎn)變）延遲0.5-1d，產(chǎn)孢時(shí)間也隨之延遲；經(jīng)顯微計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，cdc24RNAi和bem1RNAi菌株的產(chǎn)孢量較對(duì)照顯著降低，產(chǎn)孢量分別降低95％和56%。而雙干擾菌株酵母態(tài)時(shí)期的菌落更小，產(chǎn)孢量較出發(fā)菌株降低了99.04%。在AM液體培養(yǎng)基中，相對(duì)于對(duì)照組，各干擾菌株的色素積累明顯減少，同步培養(yǎng)5-7d的發(fā)酵液粘稠度也

7、明顯降低。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，各干擾菌株的菌絲體均變粗且分枝增多，bem1RNAi菌株及雙干擾菌株的菌體上產(chǎn)生許多不脫落的芽質(zhì)狀孢子，而cdc24RNAi菌株的菌體形態(tài)同對(duì)照相比則無明顯差異。此外，在同步培養(yǎng)條件下，對(duì)照組菌株在4d左右時(shí)便開始有微菌核產(chǎn)生，而干擾菌株中無微菌核產(chǎn)生；繼續(xù)培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，各干擾菌株微菌核形成的時(shí)間會(huì)延遲1-2d。干重法測微菌核的生物量顯示，cdc24RNAi和bem1RNAi菌株的生物量降低20-32%，雙干擾菌

8、株的生物量降低約為40%。另外，各處理菌株培養(yǎng)至7d左右（常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)微菌核收獲）時(shí)，相對(duì)于對(duì)照組，cdc24RNAi和bem1RNAi及雙干擾菌株的微菌核形成的數(shù)量分別下降了93.2%、90.7%和97.3%；
　　⑤采用qPCR的方法檢測在cdc24RNAi與bem1RNAi菌株中與活性氧的noxR與noxA基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，同干擾racA與cdc42基因一樣noxR與noxA表達(dá)量均明顯下降；此外，在沉默Nrcdc24基因以

9、后，racA與cdc42基因的表達(dá)量也降低，同時(shí)，在干擾的cdc42與racA菌株中Nrcdc24基因的表達(dá)量顯著升高，暗示Nrcdc24基因可能為racA與cdc42基因的上游基因，調(diào)控著二者的表達(dá)，進(jìn)而影響微菌核的形成；
　　⑥采用點(diǎn)滴接種法接種斜紋夜蛾3齡幼蟲，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，cdc24RNAi與bem1RNAi菌株對(duì)斜紋夜蛾幼蟲的致死率下降，LT50延長。通過對(duì)斜紋夜蛾幼蟲的存活曲線分析，野生型，eGFP，Nrcdc24，