肺炎克雷伯氏菌重要膜蛋白基因的功能研究.pdf

1、膜蛋白對(duì)于細(xì)胞的整個(gè)生命活動(dòng)起到非常重要的作用，生物膜中約三分之一的基因編碼合成膜蛋白。膜蛋白的生物功能包括物質(zhì)和能量的運(yùn)輸、參與信號(hào)合成與轉(zhuǎn)導(dǎo)、侵染和免疫、防御外界對(duì)菌體侵蝕、催化以及維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等，自身也作為毒力因子。病原菌膜蛋白作為藥物靶位、細(xì)胞受體和納米通道越來越受到研究者的關(guān)注。膜蛋白約為70％藥物靶標(biāo)，與醫(yī)藥制藥和生物技術(shù)方向密切相關(guān)。為此，本課題以肺炎克雷伯氏菌中膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能為對(duì)象進(jìn)行了研究。
　　本文章中第

2、一部分利用生物信息學(xué)手段，對(duì)克雷伯氏菌屬等腸科桿菌膜蛋白研究進(jìn)展進(jìn)行概括總結(jié)。根據(jù)膜蛋白在生物膜中的位置可分為內(nèi)膜蛋白和外膜蛋白，通常來說內(nèi)膜蛋白維持細(xì)胞與環(huán)境物質(zhì)，能量和信息交換的功能;外膜蛋白承擔(dān)載體運(yùn)輸，可作為特異受體、酶、表面抗原等作用。本課題就克雷伯氏菌屬膜蛋白研究進(jìn)展，利用數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI、KEGG)和文件檢索對(duì)K.pneumoniae膜蛋白基因功能的研究進(jìn)展進(jìn)行概括。同時(shí)用TMHMM server v.2.0軟件預(yù)測(cè)對(duì)Kp

3、neumoniae膜蛋白的跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，挖掘出高度保守序列。
　　膜蛋白作為細(xì)胞生命大分子也作為膜骨架具有重要意義，本課題中針對(duì)K.pneumoniae中特定膜蛋白基因，構(gòu)建了三株突變菌株分別是K.pneumoniae△pspA、K.pneumoniae△pspD、K.pneumoniae△pspA△pspD。pspA(KPN_01297)和pspD(KPN_01300)是psp基因簇中的兩個(gè)基因，它們?cè)谀承┕δ苌洗嬖诨パa(bǔ)。p

4、spA和pspD均作為內(nèi)膜蛋白對(duì)K.pneumoniae的生命活動(dòng)起重要作用，它們能將呼吸醌傳遞的電化學(xué)梯度，即質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)進(jìn)行儲(chǔ)存和反饋。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)它們進(jìn)行單基因敲除研究和雙敲菌株研究。
　　利用三株重組菌株，探究了pspA基因和pspD基因?qū).pneumoniae蛋白表達(dá)水平的影響。SDS-PAGE結(jié)果顯示在100KDa-130KDa、100KDa、35KDa-40KDa條帶表達(dá)量與對(duì)照組相比差異非常明顯。進(jìn)一步進(jìn)行MALD

5、I-TOF/TOF-MS和熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示包括與糖代謝相關(guān)的酶、外膜蛋白、孔蛋白等于細(xì)菌生長(zhǎng)密切相關(guān)的重要基因表達(dá)水平受到影響。根據(jù)這一結(jié)果，選取了ompF基因進(jìn)行Western blot的檢測(cè)，研究表明相比野生菌，ompF基因在K.Pneumoniae△pspD△pspA中翻譯量下調(diào)。
　　將重組菌株進(jìn)行掃描電鏡和原子力顯微鏡觀察其表面形態(tài)變化，觀察發(fā)現(xiàn)突變菌株表面皺褶較野生菌株少，但現(xiàn)象不明顯。
　　分別以甘