多重耐藥肺炎克雷伯菌可移動(dòng)基因組的研究.pdf

1、微生物能夠通過基因水平轉(zhuǎn)移的方式獲得致病和耐藥等相關(guān)基因。質(zhì)粒、插入序列（insertion sequence，IS）、轉(zhuǎn)座子、整合子、整合性接合元件（integrative and conjugative element，ICE）和其它基因組島等可移動(dòng)遺傳元件是推動(dòng)這一過程的關(guān)鍵遺傳介質(zhì)，這些可移動(dòng)遺傳元件組成了可移動(dòng)基因組（mobile genome，mobilome）。
　　肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumon

2、iae）為條件致病菌，目前因引發(fā)嚴(yán)重耐藥問題引起廣泛的重視。肺炎克雷伯菌 HS11286是2011年從上海某醫(yī)院臨床樣本中分離得到的耐碳青霉烯類抗生素的菌株，屬于ST11型，全基因組已完整測(cè)定。本文對(duì)其可移動(dòng)基因組進(jìn)行了識(shí)別和研究，包括6個(gè)質(zhì)粒、49個(gè)插入序列、9個(gè)轉(zhuǎn)座子、1個(gè)Class I整合子、2個(gè)ICE和7個(gè)前噬菌體。IS、轉(zhuǎn)座子和整合子多位于質(zhì)粒上。而HS11286攜帶超過20個(gè)預(yù)測(cè)的耐藥基因，其中17個(gè)也位于質(zhì)粒上，包括碳青霉

3、烯類抗生素抗性基因 blaKPC-2。遺傳背景分析表明轉(zhuǎn)座子 Tn3、Tn1721、Tn5393，整合子ΔIn2和插入序列ISCR3、ISCR2對(duì)耐藥基因的獲得有重要貢獻(xiàn)。其它插入元件對(duì)耐藥遺傳背景進(jìn)化有重要作用，其中IS26是一個(gè)高度活躍的、推動(dòng)該進(jìn)化進(jìn)程的插入序列。進(jìn)而，利用λred重組和Flp-FRT重組突變方法對(duì)blaKPC-2和一段26 kb含有13個(gè)耐藥基因的區(qū)域進(jìn)行敲除。抗菌藥物敏感性試驗(yàn)表明，缺失突變株對(duì)臨床常用抗菌藥物

4、的敏感性大幅提高，與突變后基因型相符，至此也成功構(gòu)建了可用于安全遺傳操作的模式菌株。此外，對(duì)HS11286的ICE進(jìn)行了研究。其中，ICEKpnHS11286-1帶有一個(gè)已知的毒力島；而ICEKpnHS11286-2功能未知。本研究開發(fā)了一種利用sacB反選擇的ICE敲除策略，通過篩選自然丟失該元件的方法獲得目標(biāo)突變株。應(yīng)用該方法成功獲得ICEKpnHS11286-1缺失的突變株。但發(fā)現(xiàn)該突變株在染色體上發(fā)生了非預(yù)期突變。結(jié)合序列分析和

5、實(shí)驗(yàn)方法對(duì)突變進(jìn)行了準(zhǔn)確定位，確定這種非預(yù)期突變是一種染色體重組現(xiàn)象，與ICEKpnHS11286-1重組位點(diǎn)的序列相同，可能是由該ICE整合酶介導(dǎo)的，但相關(guān)機(jī)制有待于研究。
　　ICE是一種廣泛存在于細(xì)菌中的可自主移動(dòng)元件，自身編碼重組和接合轉(zhuǎn)移所需的全部功能，攜帶多樣化附屬功能基因，是耐藥和致病基因播散的一種有效介質(zhì)，目前尚缺乏系統(tǒng)研究。我們通過文獻(xiàn)挖掘方式和生物信息學(xué)方法收集了428個(gè)ICE，并進(jìn)行分類。ICE在DNA水平呈

6、現(xiàn)多樣性，但在ICE家族內(nèi)進(jìn)行蛋白序列比較發(fā)現(xiàn)同一家族ICE擁有保守骨架和可變區(qū)域。通過基于隱馬爾科夫模型特征譜（profile hidden Markov model，profile HMM）的方法對(duì)保守蛋白進(jìn)一步比較，發(fā)現(xiàn)不同家族之間的ICE的重組和接合轉(zhuǎn)移模塊也具有保守特征。進(jìn)而，針對(duì)ICE整合模塊和接合轉(zhuǎn)移模塊收集和建立profile HMM數(shù)據(jù)集，尤其對(duì)與接合轉(zhuǎn)移相關(guān)的IV型分泌系統(tǒng)（T4SS）進(jìn)行重點(diǎn)挖掘，在531株已測(cè)序細(xì)