斜紋夜蛾轉基因技術的研究.pdf

1、piggy Bac轉座系統(tǒng)已成為在轉基因昆蟲中使用最廣的轉座子，已被證明能在20多種昆蟲中轉座。斜紋夜蛾屬鱗翅目昆蟲，是世界性分布害蟲。本研究通過顯微注射進行基因轉移，利用鱗翅目來源的轉座子piggyBac建立高效穩(wěn)定的轉基因斜紋夜蛾技術體系，為今后利用轉基因技術控制斜紋夜蛾的危害、應用于斜紋夜蛾基因的功能以及探明其發(fā)育過程的基因調控機理等基礎研究奠定基礎。
　　 1）本研究使用液壓顯微系統(tǒng)，通過制備特制注射針和選取合適的注射方

2、式，突破斜紋夜蛾堅硬卵殼的阻礙，建立起一套適合斜紋夜蛾的基因轉移方法。使用該方法，在熟練的基礎上，每小時可注射200～300粒卵。
　　 2）將注射后的卵置于飽和濕度的環(huán)境中一段時間后，注射孔的傷口能夠逐漸愈合，保護卵不會因為注射而導致其水分的流失。飽和濕度處理后幼蟲的孵化率和胚胎后期率分別達到40.9％和61.3％，其效果顯著優(yōu)于膠水封口處理和75％飽和濕度處理。
　　 3）對發(fā)育時期相同的卵，分別在其前后極注射相同濃

3、度和比例的piggyBac和helper。結果表明，與在卵前極注射相比，在卵后極部位注射后piggyBac的轉座率更高。
　　 4）對不同發(fā)育時期的卵注射顯微緩沖液，發(fā)現(xiàn)幼蟲孵化率在5 h前隨時間延后而逐漸提高，5 h后孵化率趨于相同。
　　 5）顯微操作各環(huán)節(jié)中，注射過程中的機械傷害對胚胎造成較大傷害，顯微緩沖液對胚胎的傷害小于TE緩沖液。隨著注射質粒DNA濃度的增加，卵內熒光表達率逐漸升高，而孵化率逐漸降低；質粒濃度

4、超過100 ng/μl的對幼蟲孵化率的影響較大，質粒濃度在100 ng/μ1～170ng/μl，對幼蟲孵化的影響趨于緩和。
　　 6）將濃度為140～170 ng/μl、1:1混合的piggybac和helper的混合質粒注射進入早期胚胎發(fā)育的卵中。在藍色熒光下觀察和記錄EGFP在胚胎、幼蟲及蛾中的表達情況，并對表達綠色熒光的個體進行篩選。結果發(fā)現(xiàn)：在胚胎的各個時期、G0代及其后代的1～3齡幼蟲和蛾的復眼中都觀察到了EGFP表達

5、的綠色熒光。篩選出的轉基因蟲在其第四代仍能觀察到EGFP的表達。利用PCR技術對表達EGFP的個體進行鑒定，發(fā)現(xiàn)陽性個體能擴增出EGFP片段，而陰性對照則不能，并在GO轉基因幼蟲的表皮、中腸、脂肪體及蛹的中腸均檢測到。EGFP的存在。這表明：EGFP已通過plggybac整合到斜紋夜蛾的基因組中并表達，且能夠穩(wěn)定遺傳。
　　 7）將注射piggyBac后5 h內卵的孵化率、熒光表達率及GO轉基因蟲獲得率按注射時間排序，發(fā)現(xiàn)在3

6、h左右注射可獲得最好的轉基因效率，轉基因蟲的獲得率與卵內熒光表達率緊密相關。
　　 8）本實驗共注射受精卵2576粒，注射piggyBac后，觀察到有綠色熒光表達的卵數(shù)為507粒，占注射總卵數(shù)的19.7％；注射后孵化出幼蟲424條，孵化率為16.4％。在孵化的424條幼蟲中，經(jīng)在熒光顯微鏡下篩選，共獲得46條發(fā)綠色熒光的GO代轉基因幼蟲，占注射卵數(shù)的1.78％。國際上昆蟲轉基因效率普通較低，盡管本研究得到的斜紋夜蛾轉基因效率已達