家蠶觸角氣味結(jié)合蛋白和化學(xué)感受蛋白基因的克隆、序列分析及原核表達(dá).pdf

1、家蠶(Bombyx mori Linaeus)是具有我國(guó)特色的重要資源昆蟲，目前有種桑養(yǎng)蠶的農(nóng)戶遍布20余省，絲綢工業(yè)的年總產(chǎn)值已經(jīng)超過(guò)1000億元，2003年以向仲懷院士為首的中國(guó)科學(xué)家在Science上首次報(bào)道了家蠶基因組框架圖。該圖覆蓋了家蠶基因組95％的區(qū)域，獲得了16948個(gè)完整的基因，7285個(gè)基因片段，該研究成果舉世矚目，為深入開展家蠶功能基因組研究奠定了基礎(chǔ)。 鱗翅目昆蟲除家蠶少數(shù)益蟲外，很多是我國(guó)和世界各國(guó)農(nóng)業(yè)

2、和林業(yè)的重要害蟲，如何有效防治害蟲但不污染環(huán)境是當(dāng)前生產(chǎn)中的難題，破解家蠶氣味結(jié)合蛋白和化學(xué)感受蛋白在其嗅覺信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮的作用，不僅可以指導(dǎo)蠶桑業(yè)的生產(chǎn)實(shí)踐，也可以利用這種家蠶模式生物的相關(guān)研究結(jié)果，積極應(yīng)用于鱗翅目害蟲的防治。而昆蟲觸角感受器中的氣味結(jié)合蛋白被認(rèn)為是運(yùn)輸氣味分子至嗅覺的受體，這些氣味分子多為脂溶性的小分子化合物，氣味結(jié)合蛋白溶解并運(yùn)輸脂溶性氣味化合物。是昆蟲專一性識(shí)別外界氣味物質(zhì)的第一步生化反應(yīng)，對(duì)于昆蟲與外界進(jìn)

3、行信息交流具有重要意義?；诖?，本論文開展了家蠶氣味結(jié)合蛋白(OBPs)和化學(xué)感受蛋白(CSPs)基因的克隆、序列分析、原核表達(dá)載體構(gòu)建的研究。 根據(jù)NCBI上已發(fā)表的家蠶的mRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了編碼家蠶雌雄蟲觸角氣味結(jié)合蛋白OBPs(登錄號(hào)：PBP1：NM_001044029PBP2：AM40310.PBP3：NM_001083626(30BP1：NM_001044031 GOBP2：NM_00

4、1044033)和化學(xué)感受蛋白和CSPs(登錄號(hào)：CSP1：NM_001043587 CSP2：NM_001043715 CSP3：NM_00.043599 CSP4：NM_001043597 CSP6：NM_00104360.CSP7：DQ855513 CSP8：NM_00104360.CSP10：NM_001043727 CSP12：NM_001098310 CSP14：DQ855520CSP15：NM_001098311 CSP1

5、6：NM_001098312)的cDNA片斷，并通過(guò)TA克隆的方法將其克隆至pGEM-T Easy載體，獲得了OBPs和CSPs基因成熟蛋白閱讀框序列。 利用ExPAS3，在線分析工具對(duì)所得到序列進(jìn)行分析，序列分析結(jié)果表明：家蠶OBPs分子質(zhì)量一般約為15～17kDa，N-末端有一段20個(gè)氨基酸左右的信號(hào)肽，序列中有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基。這是大多數(shù)昆蟲OBP的一個(gè)典型特征。在成熟蛋白上第40-60位約有20個(gè)親脂性氨基酸，通常

6、的模式為X18-Cys-X30-Cys-X3一Cys-X42一Cys-X8-10-Cys-X(X為任意氨基酸)，這種結(jié)構(gòu)可能與OBP結(jié)合脂溶性氣味物質(zhì)有關(guān)。6個(gè)半胱氨酸分別交叉形成3個(gè)二硫鍵，即Cys I=Cys III、Cys II=CysV和CysIV=CysVI。鱗翅目昆蟲的PBP高度保守，它們之間表現(xiàn)出中等同源性，最高達(dá)57％，GOBP1與GOBP2之間比同一亞族內(nèi)的同源性要低，如家蠶的GOBP1與GOBP2的同源性僅為51.8

7、％。CSPs是一類分子質(zhì)量約為13 kDa左右的水溶性球蛋白，有100～115個(gè)氨基酸殘基，信號(hào)肽序列約20個(gè)氨基酸殘基，有4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，形成2個(gè)二硫鍵。家蠶CSPs家族與其他昆蟲CSPs家族具有相同的特點(diǎn)，約16～20個(gè)氨基酸的疏水N-末端，可編碼信號(hào)肽，并且保守的半胱氨酸殘基具有共同的空間模型，即Cys-X6-Cys-X18-Cys-X2-Cys(X代表任意氨基酸)。與OBPs相比，CSPs的保守性更明顯，不僅同種昆蟲CS