家蠶與野桑蠶CYP6B29基因的克隆、序列分析及原核表達(dá).pdf

1、細(xì)胞色素P450單加氧化酶系在生物體對外源化合物的代謝和內(nèi)源化合物的調(diào)節(jié)都起著非常重要的作用，許多證據(jù)表明昆蟲殺蟲劑抗性的產(chǎn)生與單加氧化酶系介導(dǎo)的代謝反應(yīng)有關(guān)，其關(guān)鍵組份細(xì)胞色素P450作為終端氧化酶能氧化多樣的底物。 以家蠶基因組P450序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)了一對引物，采用RT-PCR方法分別以家蠶和野桑蠶中腸為材料提取mRNA，克隆了家蠶CYP6829基因(GenBank登錄號：DQ252324)及野桑蠶CYP6829(GenB

2、ank登錄號：DQ252325)。序列分析表明，家蠶和野桑蠶CYP6829基因編碼區(qū)長度都為1518bp，編碼505個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量約為58kD，等電點(diǎn)分別為8．29和8．49。同源比較發(fā)現(xiàn)兩者有12個(gè)堿基、6個(gè)氨基酸的差異，核苷酸和氨基酸同源性分別達(dá)到99．2％和98．8％。經(jīng)與已知P450的6B亞族其它幾乎所有成員氨基酸同源比對發(fā)現(xiàn)，家蠶和野桑蠶CYP6829基因與美洲棉鈴蟲CYP6827同源關(guān)系最近，同源性分別達(dá)到60．5％

3、和61．3％。P450的6B亞族的許多成員與昆蟲對殺蟲劑的抗性和植物毒素的代謝相關(guān)，因此推測其可能與昆蟲抗性相關(guān)。 將家蠶和野桑蠶CYP6829基因分別克隆進(jìn)原核表達(dá)載體pET-28a，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL2l細(xì)胞中，經(jīng)1mmol／LIPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析表明在約62kD大小位置，轉(zhuǎn)化家蠶和野桑蠶CYP6829的BL21菌與對照BL21菌和空pET-28a轉(zhuǎn)化BL21菌相比都出現(xiàn)了一條特異性的蛋白質(zhì)條帶，

4、推測家蠶和野桑蠶CYP6829在大腸桿菌中得到表達(dá)。然后通過Westernblot分析表明在預(yù)期的約62kD大小位置出現(xiàn)較明顯的條帶，而對照BL21菌和空pET-28a轉(zhuǎn)化BL21菌都沒有檢測到條帶，進(jìn)一步證明了家蠶和野桑蠶CYP6829得到了成功表達(dá)。但在此預(yù)期的約62kD大小位置以下出現(xiàn)了幾條小分子量條帶，而且家蠶和野蠶幾乎完全相同。經(jīng)序列分析表明，這兩個(gè)基因內(nèi)部含有大量大腸桿菌稀有密碼子，約占到1／10，因此推測這幾條較小的蛋白質(zhì)