日本三角渦蟲熱休克蛋白70和90家族相關基因表達及功能分析.pdf

1、日本三角渦蟲（Dugesia japonica）隸屬扁形動物門(Platyhelminthes)，渦蟲綱(Turbellaria)，在動物系統(tǒng)演化中占有重要地位，并且具有極強的再生能力。目前，雖然已克隆大量與渦蟲再生相關的基因，但其具體的再生機制及相關基因的功能仍不清楚。
　　本文從日本三角渦蟲轉錄組數(shù)據庫中篩選出再生過程中持續(xù)上調表達但表達量較低的熱休克蛋白70和90家族的Djhsp70e、Djhsp90a、Djhsp90b和D

2、jhsp90c基因。利用整體原位雜交、RNA干擾和Real time-PCR等分子生物學技術對四基因的時空表達模式和功能進行分析，結果如下:
　　(1)通過Real time-PCR技術對切割損傷、離子液體暴露、冷應激和熱應激環(huán)境下日本三角渦蟲體內四基因的表達量進行分析，結果顯示:在應激條件下，四基因的表達量均明顯上調，并且隨著切割損傷時間的延長、離子液體濃度的升高，四基因的表達量逐漸上升。
　　(2)日本三角渦蟲Djhsp

3、70e基因的cDNA長度為1982bp，5'端有180bp非編碼區(qū)，3'端有38bp的非翻譯區(qū)，其中包含一個長度為1764bp的最大開放閱讀框(ORF)，編碼一個由587個氨基酸構成的蛋白質，含有兩個熱休克蛋白70家族所特有的標簽序列。原位雜交結果顯示:在整體中，該基因在除腦及咽部以外的身體各部分廣泛表達，身體兩側和腸支處雜交信號較強;再生個體的芽基部位有較強的雜交信號。RNA干擾該基因后，整體渦蟲出現(xiàn)嚴重頭部溶解且不能再生，而頭再生尾

4、片段也出現(xiàn)嚴重的溶解現(xiàn)象。Real time-PCR結果表明:干擾該基因后，Djpiwi-1和Djpiwi-b的表達量明顯下調。
　　(3)日本三角渦蟲Djhsp90a基因cDNA長為3212bp，包括5'端1039bp的非編碼區(qū)和3'端22bp的非編碼區(qū)，其中包含一個長度為2151bp的ORF，編碼一個由716個氨基酸構成的蛋白質。其中包含6個熱休克蛋白90家族所特有的序列標簽。原位雜交結果顯示:在整體渦蟲中雜交信號主要分布在除

5、腦及咽以外的大部分實質組織中;在再生個體中的芽基部位有較強雜交信號。RNA干擾該基因后，整體渦蟲出現(xiàn)明顯的頭部溶解現(xiàn)象并伴有身體持續(xù)性皺縮;頭再生尾片段再生被抑制;尾再生頭片段與對照比沒有明顯變化。Real time-PCR結果表明:干擾該基因后，Djpiwi-1和Djpiwi-b的表達量明顯下調。
　　(4)日本三角渦蟲Djhsp90b基因的cDNA長度為2636bp，5'端有94bp的非編碼區(qū)和3'端有132bp非編碼區(qū)，含有

6、2409bp的最大開放閱讀框，編碼一個由802個氨基酸構成的蛋白質。該基因所推導的氨基酸序列含有5個HSP90家族所特有的標簽序列。整體原位雜交結果顯示:該基因在整體渦蟲實質組織中廣泛表達且身體兩側有較強的雜交信號;再生個體的芽基部位雜交信號較強。RNA干擾該基因后，整體渦蟲身體出現(xiàn)明顯的皺縮;頭再生尾和尾再生頭片段再生速度緩慢。Real time-PCR結果表明:干擾該基因后，Djpiwi-1和Djpiwi-b的表達量明顯下調。

7、>　　(5)日本三角渦蟲中Djhsp90c基因的cDNA長為2573bp，其中包含一個長度為2394bp的最大開放閱讀框，編碼一個由797bp氨基酸編碼的蛋白質，5'端有114bp的非編碼區(qū)，3'端有65bp的非編碼區(qū)。包含6個HSP90家族基因所特有的標簽序列。原位雜交結果顯示:該基因在整體渦蟲中雜交信號主要分布在身體兩側及尾部;再生片段芽基部位有較強的雜交信號。RNA干擾該基因后，整體渦蟲口部兩側出現(xiàn)膨脹現(xiàn)象;頭再生尾和尾再生頭片段

8、再生受到抑制。Realtime-PCR結果表明干擾該基因后，Djpiwi-1、Djpiwi-b和Djh2b基因的表達量顯著下調。
　　以上結果表明:渦蟲體內Djhsp70e、Djhsp90a、Djhsp90b和Djhsp90c基因在應激條件均具有細胞保護作用;四基因通過調控干細胞維持渦蟲體內組織平衡，并在再生過程中起重要作用。除此之外，Djhsp90c基因通過調節(jié)Djpiwi-b和Djh2b基因調節(jié)渦蟲體內干細胞的增殖和分化，是渦