血脂測(cè)定及方法學(xué)評(píng)價(jià)

1、血脂測(cè)定及方法學(xué)評(píng)價(jià),基本內(nèi)容1.基本概念2.血脂測(cè)定的常規(guī)要求3.血漿脂質(zhì)測(cè)定4.血漿脂蛋白測(cè)定5.載脂蛋白測(cè)定6.血漿脂蛋白代謝相關(guān)蛋白質(zhì)與酶的測(cè)定7.基因突變分析,基本概念,血脂血漿脂蛋白載脂蛋白脂蛋白受體HDL-C、LDL-C、VLDL-C,血脂,1.定義：指血清/漿中所有脂類物質(zhì)。2.種類：總膽固醇（游離膽固醇FC?。∧懝檀减E）　　　　　甘油三酯　　　　磷脂　　　　糖脂　　　　游離脂肪酸

2、　　　　類固醇　　　　固醇,血漿脂蛋白（lipoprotein,LP）,定義共同特征分類,血漿脂蛋白（lipoprotein,LP）,定義： 脂類不溶或微溶于水，無論是內(nèi)源性或外源性脂類均以溶解度較大的脂蛋白復(fù)合體形式在血液循環(huán)中運(yùn)輸。,LP,共同特征： 核心：不溶于水的TG和CE 外殼：少量蛋白質(zhì)和極性的PL、FFA 橋梁：PL的極性部分與Prot結(jié)合，非極性部分

3、 與其他脂類結(jié)合,LP,分類： 超速離心法： CM→VLDL→LDL→HDL→Alb-FFA complex 瓊脂糖電泳法： CM→β→前β→ α即：　 CM→VLDL→IDL→LDL→LP(a) → HDL CM　前β β　　　前β 　　α,,,,,,,,載脂蛋白(apolipoprotein, apoprotein,Apo),定義：脂蛋白中的蛋白質(zhì)部分，具有結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)

4、脂質(zhì)、穩(wěn)定LP，作為脂蛋白受體的配體，參與脂蛋白與細(xì)胞表面脂蛋白受體的結(jié)合及其代謝過程，激活某些與血漿脂蛋白代謝有關(guān)的酶類等作用。分類： Apo A、B、C、D、E、H、J、（a） Apo A（AⅠ、 AⅡ 、AⅣ） Apo B（ B 100、 B48） Apo C（CⅠ、 C Ⅱ、CⅢ 0~2）,脂蛋白受體,定

5、義：一類位于細(xì)胞膜上的糖蛋白。以高度的親和方式與相應(yīng)的脂蛋白配體作用，從而介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)LP的攝取與代謝，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞外LP的水平。類型： LDL受體 VLDL受體 清道夫受體,HDL-C、LDL-C、VLDL-C,在LP中有prot、ch、PL等，其中ch含量較為穩(wěn)定，目前以測(cè)定LP中ch含量的方法作為LP的定量依據(jù)。,血脂測(cè)定的常規(guī)要求,在顯著改變飲食習(xí)慣后應(yīng)等待3~6個(gè)月

6、測(cè)血脂，同時(shí)要求體重恒定。采血前12h不要飲酒、咖啡、奶病人禁食12h以上，采取靜脈血（止血帶使用不多于1min），采血時(shí)病人取坐位或半臥位（抽血前至少靜坐5min，站立使血脂↑）血脂與年齡、性別、種族等生物因素有關(guān)血脂與飲食習(xí)慣、吸煙、運(yùn)動(dòng)及應(yīng)激等生活方式有關(guān)血脂與臨床（疾病、藥物）有關(guān)血脂與血標(biāo)本采集與處理有關(guān)一般多用血清標(biāo)本，用血漿時(shí)選用EDTA-Na2抗凝，不用肝素四個(gè)基本指標(biāo)（TC、TG、HDL-C、LDL-C

7、）在4℃保存3天，-20 ℃穩(wěn)定數(shù)周，-70 ℃以下長期保存一次檢查結(jié)果可疑應(yīng)幾周后復(fù)查再作診斷,血漿脂質(zhì)測(cè)定,1.總脂質(zhì)測(cè)定2.總膽固醇（TC）測(cè)定3.甘油三酯（TG）測(cè)定4.磷脂測(cè)定5.游離脂肪酸測(cè)定,總脂質(zhì)測(cè)定,方法： 1. 脂質(zhì)抽提法 2. 直接測(cè)定法,總膽固醇（TC）測(cè)定,CE占70%，F(xiàn)C占30%分布：LDL中最多 其次是HDL和VLDL CM最少意義

8、： TC高低通常反映LDL-C的高低，但在一定程度上也受HDL-C和VLDL-C水平的影響。,總膽固醇（TC）測(cè)定方法,同位素稀釋-質(zhì)譜分析法（ID-MS）：決定性方法化學(xué)法：其中ALBK法為參考方法酶法：其中膽固醇氧化酶法為常規(guī)方法,TC測(cè)定的化學(xué)試劑顯色法（強(qiáng)酸試劑顯色法）,步驟： 1.抽提（正己烷、乙醇、石油醚等） ↓ 2.皂化（KOH） ↓ 3.洋地黃皂苷沉淀純化 ↓

9、 4.顯色比色 Zak反應(yīng)： ch+濃h2so4+Fe3++冰醋酸→紫色 （563nm） L-B反應(yīng)： ch+濃h2so4+醋酸酐+冰醋酸→綠色（410nm）,四步法三步法（正己烷抽提L-B反應(yīng)顯色為公認(rèn)的參考方法）二步法一步法：其中LB反應(yīng)直接法 為常規(guī)方法,TC測(cè)定

10、的膽固醇氧化酶法,原理： CE 膽固醇酯酶（CHE） FC＋FFA ch＋O2 膽固醇氧化酶（COD） 膽烷-4-烯-3-酮＋H2O2 氧電極 240nm比色 Trinder反應(yīng)

11、 （即CHOD-PAP法，最常用）評(píng)價(jià)：快速、準(zhǔn)確、標(biāo)本用量少，便于自動(dòng)化。,,,,TG測(cè)定,分布： 主要存在于CM及VLDL中，但空腹血中出現(xiàn)CM是少見的，故空腹血中TG↑代表VLDL ↑。方法： 化學(xué)法：操作煩瑣

12、，影響因素多，準(zhǔn)確性差，現(xiàn)較少采用。 酶法：操作簡便，快速準(zhǔn)確，可在自動(dòng)化儀器上批量測(cè)定。,化學(xué)法測(cè)定TG,基本步驟： 抽提：提取TG，去除PL、游離甘油、Glu等干擾 常選用正壬烷/正庚烷-異丙醇-稀硫酸抽提劑 皂化： KOH 水解,,,甘油,TG,,甘油,,甲醛＋甲酸,HIO4,,氧化：,

13、顯色：,A.變色酸顯色法：氯仿提取變色酸顯色法為常規(guī)方法B.乙酰丙酮顯色法：較簡便，常用方法C.鹽酸苯肼-高鐵氰化鉀法D.三氮唑法,乙酰丙酮顯色法,Hantgsch反應(yīng)：,甲醛＋乙酰丙酮,,NH4+,3,5-二乙酰-1,4-二氫二甲基吡啶（帶黃色的熒光物質(zhì)，λ412nm),CDC認(rèn)為變色酸法與乙酰丙酮熒光法可以為參考方法,酶法測(cè)TG,小結(jié)：,TG,,LPL,甘油,,甘油激酶法： （GK),甘油＋ATP,,GK,3-磷酸甘油

14、 ＋ ADP,,磷酸甘油脫氫酶法,,磷酸甘油氧化酶法,丙酮酸激酶-LDH法,,,甘油脫氫酶法,甘油氧化酶法,,磷酸甘油氧化酶法測(cè)TG,原理：,TG + H2O,,脂蛋白酯酶（LPL）,甘油＋FFA,甘油＋ATP,,甘油激酶（GK）,Mg2+,甘油-3-P ＋ ADP,甘油-3-P ＋O2,,磷酸甘油氧化酶（GPO）,磷酸二羥丙酮+H2O2,H2O2＋4-AAP+4-氯酚,,POD,醌亞胺＋H2O＋HCL,評(píng)價(jià)：準(zhǔn)確

15、、靈敏，試劑穩(wěn)定，線性范圍較寬。但要設(shè)空白 去除FG的干擾。 其中兩步法為中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)的推薦方法。,甘油氧化酶法測(cè)TG,,第一步反應(yīng)：去除游離甘油（FG）,FG+O2,,甘油氧化酶(GlyOD),甘油醛+H2O2,H2O2+EMAE,,POD,無色物質(zhì),第二步反應(yīng)：測(cè)定TG。在第一步反應(yīng)3～5min后進(jìn)行,TG+3H2O,,LPL,甘油+FFA,甘油+O2,甘油氧化酶(GlyOD),,甘油醛

16、+H2O2,H2O2+4-AAP+EMAE,POD,,有色物質(zhì),磷脂測(cè)定,化學(xué)法酶法,FFA測(cè)定,酶法滴定法比色法AASHPLC,血漿脂蛋白測(cè)定,通常認(rèn)為HDL是動(dòng)脈粥樣硬化的防御因素通常認(rèn)為LDL是動(dòng)脈粥樣硬化的致病因素 這兩類LP的測(cè)定是測(cè)其所含的膽固醇（ HDL-C與 LDL-C）LP(a)的水平高是心腦血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,血漿脂蛋白測(cè)定,1.超速離心分離純化法：多為CDC的參考方法2.電泳分離法：主要用于

17、定性3.血漿靜置實(shí)驗(yàn)：詳見臨床生化理論課4.血漿脂蛋白膽固醇測(cè)定： 1) HDL-C 2) LDL-C 3) LP(a),沉淀分離LP,原理： 由于LP的組成與理化性質(zhì)不同，在不同的聚陰離子（PEG、肝素、磷鎢酸等）和不同2價(jià)金屬離子以及不同PH值條件下，使LP與聚陰離子結(jié)合形成復(fù)合物沉淀，以達(dá)到分離測(cè)定的目的。舉例： 肝素-Mn2+沉淀LDL與VLDL 磷鎢酸鈉-Mg2+

18、沉淀LDL與VLDL 聚乙烯硫酸鹽沉淀LDL,HDL-C測(cè)定,化學(xué)沉淀法：磷鎢酸- Mg2+沉淀法為常規(guī)方法均相測(cè)定法免疫法,LDL-C測(cè)定,計(jì)算法：LDL-C=TC - [HDL-C + (TG 1/5)]化學(xué)沉淀法：聚乙烯硫酸鹽沉淀法(PVS)為常規(guī)方法免疫分離法：準(zhǔn)確、精密，但成本高勻相測(cè)定法：表面活性劑消除法目前應(yīng)用最廣,,,LP(a)測(cè)定,免疫法：ITA、INA、ELISA、RIA、RID等LP(a)