斜帶石斑魚抗溶藻弧菌單鏈抗體ScFv的構建及活性檢測.pdf

1、近年來，單鏈抗體技術的發(fā)展非常迅速，并被廣泛地應用于人類疾病的研究中，但是在水產領域中的應用卻鮮有報導。本論文的目的是構建斜帶石斑魚抗溶藻弧菌單鏈抗體，并對其原核表達產物與溶藻弧菌的結合活性進行檢測。本實驗設計引物所用的序列來自實驗室構建的經溶藻弧菌感染后的斜帶石斑魚外周血淋巴以及頭腎Smart cDNA文庫，經測序后發(fā)現的大量的免疫球蛋白重鏈與輕鏈的基因，這為斜帶石斑魚抗溶藻弧菌單鏈抗體的構建提供了豐富的材料，通過對測序得到的免疫球蛋

2、白可變區(qū)序列進行分析，根據其可變區(qū)的框架一區(qū)(FR1)和框架四區(qū)(FR4)篩選出一類豐度較高的重鏈的可變區(qū)(VH)與輕鏈的可變區(qū)(VL)基因序列，并分別按照這兩類序列的框架一區(qū)(FR-1)和框架四區(qū)(FR4)設計引物進行VH、VL的擴增，在Vn的5’端、VL的3’端分別加上Nde I和Xho I酶切位點以便與表達載體pET-21a連接，中間以一段柔和的多肽(Gly4Ser)3(linker)按Vx-linker-VL的形式連接后構建抗溶

3、藻弧菌的單鏈抗體(SeFv)的原核表達質粒pET21a-S，經測序后得到ScFv基因序列全長705堿基對，編碼235個氨基酸，符合魚類免疫球蛋白可變區(qū)基因的特征，含有框架區(qū)(FRs)、抗原互補區(qū)(CDRs)以及免疫球蛋白特征性的半胱氨酸殘基，證明ScFv基因構建成功，于是用該質粒轉化大腸桿菌BL21后用IPTG進行誘導表達，并在37℃、28℃、16℃分別進行了表達，結果顯示在三個溫度下ScFv均以包涵體的形式進行表達，分子量為24.8k

4、Da；所得蛋白純化后，用ELISA進行抗原結合活性檢測其效價為1:3200；隨后再用表達的ScFv蛋白與佐劑混合后對體重約2kg的新西蘭大白兔進行免疫制備多克隆抗體，免疫程序結束后抽血并分離血清，檢測血清中抗ScFv的多克隆抗體的效價為1:10000. 本實驗成功構建了斜帶石斑魚抗溶藻弧菌單鏈抗體ScFv，并成功進行了原核表達以及表達產物的純化，用ELISA檢測了ScFv與抗原(溶藻弧菌)的結合活性，其結果顯示ScFv與溶藻弧菌