半胱胺調(diào)控斜帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)的分子機(jī)理研究.pdf

1、魚(yú)類生長(zhǎng)的內(nèi)分泌調(diào)控是通過(guò)刺激性和抑制性因子的雙重作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。生長(zhǎng)抑素(somatostatin，SS)正是生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)基礎(chǔ)性和刺激性分泌的最主要的抑制性因子。半胱胺可以通過(guò)抑制或削弱生長(zhǎng)抑素作用，直接或間接的刺激GH的釋放，從而促進(jìn)生長(zhǎng)。本論文首次從斜帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides)肝臟克隆了2種不同類型的斜帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)激素受體(gGHR1和gGHR2)。比較了2種生長(zhǎng)激素受體的分

2、子結(jié)構(gòu)，同源性以及進(jìn)化關(guān)系。運(yùn)用Real-time PCR技術(shù)結(jié)合Northern雜交技術(shù)對(duì)2種生長(zhǎng)激素受體在斜帶石斑魚(yú)不同組織表達(dá)情況進(jìn)行了研究；通過(guò)RT-PCR技術(shù)研究了2種生長(zhǎng)激素受體在斜帶石斑魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況。通過(guò)拌料投喂實(shí)驗(yàn)，研究了不同劑量半胱胺(CS)以及促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A)對(duì)斜帶石斑魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響，從而尋找出一種合適劑量的CSH與LHRH-A藥物組合，指導(dǎo)斜帶石斑魚(yú)的人工養(yǎng)殖。 本研究

3、采用．RT-PCR以及RACE技術(shù)，從斜帶石斑魚(yú)肝臟克隆了2種不同類型的生長(zhǎng)激素受體cDNA。斜帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)激素受體1型(gGHRl)cDNA全長(zhǎng)2673bp(NCBI GenBank序列號(hào)，EF052273)，編碼658個(gè)氨基酸，其中胞外區(qū)為273個(gè)氨基酸，單次跨膜區(qū)為21個(gè)氨基酸，胞內(nèi)區(qū)為364個(gè)氨基酸；斜帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)激素受體2型(gGHR2)cDNA全長(zhǎng)2989bp(NCBI GenBank序列號(hào)，EF052274)，編碼577個(gè)

4、氨基酸，其中胞外區(qū)為244個(gè)氨基酸，單次跨膜區(qū)為20個(gè)氨基酸，胞內(nèi)區(qū)為314個(gè)氨基酸。2種gGHR序列擁有78.6﹪的核苷酸同源性以及37.8﹪的氨基酸同源性。通過(guò)Northern雜交實(shí)驗(yàn)，我們?cè)谛睅唪~(yú)肝臟組織檢測(cè)到了單一的gGHR1信號(hào)，同時(shí)在斜帶石斑魚(yú)肝臟和肌肉組織測(cè)到了單一的gGHR2信號(hào)。在不同種類硬骨魚(yú)生長(zhǎng)激素受體同源性分析中我們發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚(yú)gGHR1同鱸形目(黑鯛，金頭鯛，尼羅羅非魚(yú))以及鰈形目(牙鲆，大菱鲆)魚(yú)類的

5、GHRl具有很高的同源性(81.3﹪．86.9﹪)；斜帶石斑魚(yú)gGHR2同鱸形目的一些魚(yú)類(黑鯛，金頭鯛，尼羅羅非魚(yú))的GHRl具有很高的同源性(71.8﹪-80.4﹪)。 對(duì)硬骨魚(yú)生長(zhǎng)激素受體的進(jìn)化關(guān)系也進(jìn)行了分析。斜帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)激素受體同鱸形目以及鰈形目的一些魚(yú)類的生長(zhǎng)激素受體具有較近的進(jìn)化親緣關(guān)系，而與鯉形目，鯰形目，鮭形目和鰻形目的一些魚(yú)類的生長(zhǎng)激素受體具有較低的進(jìn)化親緣關(guān)系。 采用Real-time PCR技術(shù)

6、對(duì)斜帶石斑魚(yú)2種gGHR的組織分布情況進(jìn)行了研究。在垂體，下丘腦，脊髓，心臟，肝臟，肌肉等18種被測(cè)組織中均有檢測(cè)到2種gGHR的表達(dá)。在腦區(qū)，gGHR1在垂體中的表達(dá)量最高，在小腦和下丘腦的表達(dá)量最低；gGHR2在垂體，端腦和小腦的表達(dá)量最高，在下丘腦的表達(dá)量最低。在外周組織，2種gGHR在肝臟表達(dá)量最高，其次是肌肉和脂肪，而在其他外周組織表達(dá)量很低。同時(shí)采用Real-time PCR技術(shù)還比較了在同一組織中2種gGHR的表達(dá)差異。在

7、大多數(shù)組織，如：端腦，小腦，垂體，心臟和肌肉，gGHR2的表達(dá)量明顯高于gGHRl；而在肝臟和脊髓，gGHRl的表達(dá)量明顯高于gGHR2。同時(shí)采用RT-PCR技術(shù)研究了2種生長(zhǎng)激素受體在斜帶石斑魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況。斜帶石斑魚(yú)2種GHR mRNA在受精卵初期就可以檢測(cè)到表達(dá)，并且在胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期都有顯著表達(dá)。 半胱胺鹽酸鹽(CSH)單獨(dú)投喂實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同劑量的CSH均能顯著促進(jìn)斜帶石斑魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)，提高魚(yú)體的肥滿度，對(duì)魚(yú)

8、體的內(nèi)臟比例沒(méi)有影響。CSH的促生長(zhǎng)效果在一定范圍內(nèi)與劑量成正比。同時(shí)，運(yùn)用：Real-time PCR技術(shù)對(duì)不同處理后的斜帶石斑魚(yú)GH及2種gGHR mRNA水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CSH可以劑量依存的方式促進(jìn)斜帶石斑魚(yú)腦垂體GH mRNA水平；同時(shí)，低劑量的CSH(1-3mg/g diet)可以劑量依存的方式提高斜帶石斑魚(yú)肝臟2種gGHR mRNA水平；而高劑量的CSH(4mg/g diet)則抑制2種gGHR mRNA水平，這可能同低劑

9、量的GH對(duì)GHR的上調(diào)節(jié)以及高劑量的GH對(duì)GHR的下調(diào)節(jié)有關(guān)。此外還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于CSH刺激的敏感度上，gGHR2要明顯高于gGHR1。促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A)單獨(dú)投喂實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量的LHRH-A均能顯著促進(jìn)斜帶石斑魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)，提高魚(yú)體的肥滿度，同時(shí)對(duì)魚(yú)體的內(nèi)臟比例沒(méi)有影響。其對(duì)斜帶石斑魚(yú)幼魚(yú)的促生長(zhǎng)效果在一定范圍內(nèi)與劑量成正比。 最后通過(guò)混合投喂實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)CSH與LHRH-A混合投喂能顯著促進(jìn)斜帶石斑魚(yú)