水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因檢測方法國際協(xié)同驗證及四種轉(zhuǎn)基因棉花品系特異性檢測方法研究.pdf

1、為了保障全球各國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識管理制度的順利實施，針對轉(zhuǎn)基因水稻檢測方法中存在內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因檢測方法不統(tǒng)一、轉(zhuǎn)基因棉花品系特異性檢測方法有待完善等問題，本文開展了相關(guān)針對性研究。 1. 適合轉(zhuǎn)基因水稻定性定量PCR 檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的國際協(xié)同驗證：根據(jù)我們已經(jīng)建立的水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Sucrose Phosphate Synthase(SPS)定性定量PCR 檢測體系，優(yōu)化定性定量PCR 引物、探針濃度、序列和熒光標(biāo)記位點，建立了穩(wěn)定高

2、效的SPS 定性和定量PCR 檢測系統(tǒng)，并組織開展了在國際間實驗室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因檢測方法的驗證,該國際協(xié)同實驗邀請國內(nèi)外7個國家12個實驗室分別對水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SPS 進行驗證。結(jié)果表明，SPS基因符合轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測需要的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的三個特征，即種間特異性，種內(nèi)非特異性和恒定的低拷貝數(shù)。協(xié)同實驗驗證SPS定性PCR 檢測方法的檢測下限能夠到達0.1％。定量PCR檢測方法的檢測下限和定量下限至少為23個拷貝，并且具有良好的反應(yīng)效率和線性相關(guān)系

3、數(shù)。采用SPS 定量PCR 方法對8個水稻盲樣分析的偏差在5.22％到26.52％之間。因此說明SPS 適合作為水稻的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，適合用于對轉(zhuǎn)基因水稻樣品進行定性和定量PCR 檢測。 2. 根據(jù)我國已經(jīng)批準(zhǔn)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因棉花Mon15985的5’端旁側(cè)序列和正在批準(zhǔn)商業(yè)化中的轉(zhuǎn)基因棉花Mon88913的3’端旁側(cè)序列，設(shè)計引物和探針，通過優(yōu)化定性定量PCR 檢測方法的引物探針濃度，PCR 檢測體系，建立了轉(zhuǎn)基因棉花Mon1598

4、5和Mon88913的品系特異性定性和定量PCR 檢測方法，結(jié)果證明了這兩種轉(zhuǎn)基因棉花品系特異性定性PCR 檢測方法具有高特異性，靈敏度達到0.05％，定量PCR 檢測方法的檢測下限和定量下限分別約10和17個拷貝。在此基礎(chǔ)上，我們在實驗室內(nèi)部組織了5 人的協(xié)同實驗驗證，結(jié)果表明這兩種轉(zhuǎn)基因棉花的品系特異性定量PCR 檢測方法具有高PCR 擴增效率，高線性相關(guān)系數(shù)的特點。并且對5個濃度梯度的轉(zhuǎn)基因棉花混合樣品的定量檢測結(jié)果與其實際結(jié)果的

5、偏差在25％范圍內(nèi)。結(jié)果表明所建立的兩種轉(zhuǎn)基因棉花品系特異性PCR 檢測方法完全適用于這兩種轉(zhuǎn)基因棉花及其衍生物的鑒定和定量分析。另外，我們根據(jù)已報道的兩種轉(zhuǎn)基因棉花Mon1445和Mon531的品系特異性檢測方法和本研究建立的Mon15985和Mon88913 品系特異性檢測方法，建立四種轉(zhuǎn)基因棉花（Mon88913，Mon15985，Mon1445和Mon531）復(fù)合品系特異性定性PCR 檢測方法。該復(fù)合定性PCR 檢測方法在轉(zhuǎn)基因