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1、乙型肝炎病毒(HBV)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)是HBV復(fù)制早期即開(kāi)始合成一種中間體,由cccDNA反轉(zhuǎn)錄形成pgRNA及其他一系列RNA,開(kāi)始病毒的復(fù)制增殖,cccDNA存在及數(shù)量標(biāo)志著HBV的復(fù)制和復(fù)制的活躍程度。cccDNA的檢測(cè)在HBV清除機(jī)制研究、抗HBV藥物機(jī)制及藥效學(xué)研究、對(duì)不同的乙型肝炎患者病情變化的監(jiān)測(cè)均有重要的應(yīng)用價(jià)值。但由于其結(jié)構(gòu)上和生物學(xué)方面的特殊性
2、,cccDNA特異性檢測(cè)一直存在較大的難度。自二十世紀(jì)90年代初,不斷有學(xué)者發(fā)明新的cccDNA特異性檢測(cè)方法,但均未能推廣。另外,目前有關(guān)cccDNA的研究數(shù)據(jù)大多通過(guò)鴨、土撥鼠、黑猩猩等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和細(xì)胞模型中獲得,而直接從慢性乙型肝炎患者等臨床病人中獲得的資料仍然比較缺乏。本課題從目前有關(guān)cccDNA特異性檢測(cè)方法中篩選幾種可能性比較大的方法進(jìn)行驗(yàn)證,將能確切提高cccDNA檢測(cè)特異性和靈敏度的方法進(jìn)行優(yōu)化,作為一種方法的幾個(gè)步驟
3、組合起來(lái),并用此方法檢測(cè)肝移植術(shù)后不同時(shí)期患者的外周血單個(gè)核白細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)及慢性乙型肝炎患者的PBMC和肝組織穿刺標(biāo)本。 本課題分為三個(gè)部分:一、HBVcccDNA特異性檢測(cè)方法的篩選及優(yōu)化;二、慢性乙型肝炎患者PBMC及肝組織中HBVcccDNA定量檢測(cè);三、肝移植患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中HBV檢測(cè)及臨床意義。 一、HBVcccDNA特異性檢測(cè)方法的篩選及
4、優(yōu)化目的對(duì)目前幾種cccDNA特異性檢測(cè)方法進(jìn)行篩選,選擇能更好地提高cccDNA檢測(cè)特異性的幾個(gè)方法組合起來(lái),并將此組合的方法進(jìn)行優(yōu)化完善。方法根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,選擇理論上可以提高cccDNA檢測(cè)特異性的幾種方法:十二烷基硫酸鉀(potassiumdodecylsulfate,PDS)-蛋白質(zhì)沉淀核酸抽提法,嵌合引物(chimericprimer)cccDNA特異性檢測(cè)法,特異性核酸酶切法,跨rcDNA缺口的PCR擴(kuò)增法和實(shí)時(shí)熒光PCR法
5、等,以慢性乙型肝炎患者血清、肝組織標(biāo)本及HBV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品鑒定、選擇最佳的幾個(gè)方法,作為分步驟組合為一個(gè)新的方法,再對(duì)每個(gè)步驟進(jìn)行優(yōu)化,提高檢測(cè)方法的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性。結(jié)果抽提HBV核酸后,先用不降解質(zhì)粒的ATP依賴DNA酶(Plasmid-SafeATP-dependentDNase,PSAD)特異性切除非cccDNA核酸,再以跨rcDNA缺口的熒光PCR定量法檢測(cè),10份HBVrcDNA高滴度(107拷貝/m1)血清均未出現(xiàn)cc
6、cDNA假陽(yáng)性結(jié)果,用HBV質(zhì)粒驗(yàn)證其靈敏度可達(dá)103拷貝/ml,并且cccDNA的檢測(cè)可與總HBVDNA及β-actin采用相同的熒光PCR退火溫度。結(jié)論該方法定量檢測(cè)HBVcccDNA,特異性高,敏感性較好,與總HBVDNA及β-actin同時(shí)檢測(cè)可減少誤差。 定量檢測(cè)二、慢性乙型肝炎患者PBMC及肝組織中HBVcccDNA定量檢測(cè) 目的觀察HBVcccDNA在慢性乙型肝炎患者PBMC及肝組織中的存在及分布情況。方法
7、標(biāo)本抽提核酸后,以PSAD進(jìn)行酶切,再以跨雙缺口的特異性引物進(jìn)行熒光PCR定量檢測(cè)HBVcccDNA;取慢性乙型肝炎患者PBMC和肝組織穿刺標(biāo)本各50份,檢測(cè)其總HBVDNA和cccDNA。結(jié)果所有肝組織中總HBVDNA和cccDNA檢測(cè)均陽(yáng)性,總HBVDNA含量為3.19×102~6.69×107拷貝/μg人基因組DNA,cccDNA含量為7.32×100~6.51×106拷貝/μg人基因組DNA,同一患者肝組織中總HBVDNA含量是
8、cccDNA含量的10.7倍至9.2×105倍。結(jié)論P(yáng)BMC不能支持HBV的復(fù)制。在慢性乙肝患者的肝組織中均可檢測(cè)到cccDNA,但其水平并非與細(xì)胞內(nèi)總HBVDNA水平正相關(guān),是否有其它影響因素如患者免疫狀態(tài)、病情輕重等值得進(jìn)一步研究。 三、肝移植患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中HBV檢測(cè)及臨床意義 目的研究乙肝肝硬化終末期患者肝移植后外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)HBVDNA狀態(tài)及臨床意義。方法應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)乙肝肝
9、硬化終末期肝移植術(shù)后30例患者血清及PBMC標(biāo)本HBVDNA,并用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和管家基因β-actin標(biāo)定PBMCHBVDNA,觀察PBMCHBVDNA與血清HBVDNA定量關(guān)系;觀察患者肝移植術(shù)后不同時(shí)間PBMCHBVDNA水平。30例對(duì)照組為肝炎肝硬化失代償期患者。結(jié)果移植后患者19份(63%)PBMC標(biāo)本HBVDNA陽(yáng)性,低于對(duì)照組(87%,26/30)。以Ct值為定量參數(shù),移植后患者PBMCHBVDNA水平顯著低于對(duì)照組(P=0.
10、02);肝移植術(shù)后患者PBMCHBVDNA長(zhǎng)期維持于103~104拷貝/106細(xì)胞水平,與肝移植后時(shí)間無(wú)明顯關(guān)系。移植后患者血清HBVDNA均陰性,而對(duì)照組血清陽(yáng)性率為48%。結(jié)論乙肝肝硬化終末期患者肝移植術(shù)后,經(jīng)過(guò)有效的預(yù)防HBV再感染治療后,雖然血清中不能測(cè)出HBVDNA,但相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間里,PBMC中仍能檢出HBV,提示在血細(xì)胞生活周期的某個(gè)階段,或是在血細(xì)胞發(fā)育環(huán)境中如骨髓中的造血細(xì)胞或組織細(xì)胞中,可能存在HBV肝外復(fù)制形式并
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